FCM樣本制作(精編)

1、流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備 汪洪濤 C座402bb_wanghongtao126 9/13/20221流式細(xì)胞儀BD公司 FACS Calibur9/13/20222 但凡能被熒光素標(biāo)記的且這種熒光素能被流式細(xì)胞儀所配置的激光光源激發(fā)的細(xì)胞或顆粒，都可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在生物檢測(cè)技術(shù)中流式細(xì)胞儀是不可多得的一機(jī)多用的儀器。 FCM的應(yīng)用廣泛：9/13/202239/13/20224流式參與研究的學(xué)科種類9/13/20225應(yīng)用流式發(fā)表的論文統(tǒng)計(jì)9/13/20226怎樣利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行科學(xué)研究呢？9/13/20227流式細(xì)胞儀的特點(diǎn)單個(gè)細(xì)胞分析同時(shí)多參數(shù)分析速度快：10000個(gè)細(xì)胞/秒統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：提

2、供細(xì)胞群體的均值和分布情況分選感興趣的細(xì)胞9/13/20228FCM的液流系統(tǒng)如何形成單個(gè)細(xì)胞流樣本管鞘液管9/13/202292 main sorts of parameters are measured Light Scatter Fluorescence流式的工作原理9/13/202210Light Scatter 流式細(xì)胞儀的散射光信號(hào)9/13/202211Light Scatter9/13/202212 流式細(xì)胞儀的散射光信號(hào)FSC:表示細(xì)胞大小SSC:表示細(xì)胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜程度9/13/202213光 源FSC測(cè)大小SSC測(cè)粒度SSC cell 粒度FSC cell 體積散射光信號(hào)流

3、式細(xì)胞儀信號(hào)獲取與分析9/13/202214外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖紅細(xì)胞溶解后9/13/202215熒光信號(hào)熒光素吸收激光能量熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為振動(dòng)能和熱能釋放較入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光量子熒光素與特異抗體結(jié)合熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號(hào)越強(qiáng)Fluorescence9/13/202216Fluorescence1.自身熒光即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光 A.細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子(例核黃素、細(xì)胞 色素等)的含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；B.培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞/活細(xì)胞比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；9/13/2022172.特異性熒光由細(xì)胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光

4、照而發(fā)出的熒光 9/13/202218熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)9/13/202219熒光素的選擇1.熒光染料有多種,他們分子結(jié)構(gòu)不同,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異熒光素發(fā)光原理略2.選擇熒光染料時(shí)必須依據(jù)流式細(xì)胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長(zhǎng)(如氬離子氣體激光管,它的發(fā)射光波488nm,氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長(zhǎng)633nm 激發(fā)光波長(zhǎng)nm 發(fā)射光峰值nmFITC 488 525綠PE 488 575橙紅 PI 488 630橙紅ECD 488 610紅CY5 488 675深紅PreCP 488 675深紅9/13/2022203. 抗原豐富度決定熒

5、光素的選擇 高密度表達(dá)的抗原我們可以應(yīng)用任何熒光素標(biāo)記的抗體來檢測(cè)，低密度表達(dá)的抗原就需要我們應(yīng)用高信噪比高的熒光素例如：細(xì)胞外表的CD3 細(xì)胞產(chǎn)生的IFN- 可以用任何熒 光素標(biāo)記的抗體 而IL-4那么最好用APC等高信噪比的熒光素標(biāo)記的抗體9/13/202221Direct StainingCD4+ cell plus monoclonal antibody to CD4 conjugated with FITC9/13/202222Indirect StainingCD4+ cell plusunconjugated antibody to CD4 plus FITC conjugate

6、d goat-anti-mouse IgG as secondary antibody. 9/13/202223抗體的選擇首選直接標(biāo)記抗體熒光分子 PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原 FITC最廉價(jià)，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原間接標(biāo)記：一般不提倡用9/13/202224流式細(xì)胞儀測(cè)定的是單個(gè)粒子的熒光 要求樣本必須是單細(xì)胞的懸液 如何制作樣本？單層培養(yǎng)細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞實(shí)體組織分散成單個(gè)細(xì)胞染色等操作9/13/202225實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理單細(xì)胞懸液的制備：胰酶消化抗體或標(biāo)記分子的染色：抗原抗體反響非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉 封閉：血清和同型抗體9/13/202226一、單層培養(yǎng)細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞操作步驟適用細(xì)胞

7、：貼壁生長(zhǎng)，如3T3 Hela1.將單層培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期舊培養(yǎng)液倒掉2.加少量0.25%胰酶，過一遍瓶后倒掉3.參加1-2ml 0.25%胰酶，在倒置顯微鏡下觀察9/13/202227剛參加胰酶，細(xì)胞仍呈致密單層 細(xì)胞開始皺縮但不明顯，仍維持細(xì)胞正常形態(tài) 9/13/202228細(xì)胞根本皺縮變圓，此時(shí)細(xì)胞吹打可下 細(xì)胞完全皺縮變圓，此時(shí)應(yīng)棄去胰酶，參加培養(yǎng)基后輕搖可將細(xì)胞從細(xì)胞瓶壁上洗下 9/13/2022294.參加染色緩沖液PBS+1%BSA，反復(fù)吹打，使之成為單細(xì)胞懸液5.移入離心管內(nèi)，離心 1000-1500rpm 5min6.棄上清，重懸管內(nèi)細(xì)胞后，加染色緩沖液，洗滌細(xì)胞9/13/2

8、02230二、實(shí)體組織分散成單個(gè)細(xì)胞機(jī)械法剪刀剪碎、手術(shù)刀切碎、勻漿器勻漿、尼龍網(wǎng)或者不銹鋼網(wǎng)酶處理法胰酶、膠原酶 溶菌酶 木瓜蛋白酶等等單純采用機(jī)械或者酶處理法效果都不太理想，往往是將兩者結(jié)合9/13/202231實(shí)體瘤分散試驗(yàn)實(shí)例：1.從動(dòng)物身上取瘤后，立即投入4度含有10NCS的培養(yǎng)介質(zhì)中2.取0.20.5g瘤組織并切碎3.切碎瘤組織放入混合酶液中DNA酶膠原酶鏈霉蛋白酶4.37度 消化3060min5.過濾，離心，棄上清6.用含10NCS的培養(yǎng)介質(zhì)洗滌細(xì)胞2次7.重懸細(xì)胞300目或者400目37um濾網(wǎng)過濾 目x孔徑154009/13/202232單細(xì)胞懸液的處理根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，?/p>

9、理過程亦不相同細(xì)胞外表標(biāo)記分子檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子分析細(xì)胞周期分析細(xì)胞早期凋亡分析9/13/202233細(xì)胞外表標(biāo)記分子檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群分析抗凝外周靜脈血 1030ul染色溶血?jiǎng)┤苎旧彌_液洗滌1PFA固定15分鐘上流式檢測(cè)管號(hào)檢測(cè)項(xiàng)目 熒光抗體1空白對(duì)照不加任何抗體2調(diào)補(bǔ)償管Anti-CD3-FITC3調(diào)補(bǔ)償管Anti-CD4-PE4同型對(duì)照IgG1-FITC /IgG2-PE5CD4+TAnti-CD3FITC+CD4PE6CD8+TantiCD3FITC+CD8PE7 B cellantiCD3FITC+CD19PE8NK cellantiCD3FITC+CD16/56PE9/13/202

10、234淋巴細(xì)胞亞群報(bào)告模式CD4+CD8+9/13/202235胞內(nèi)細(xì)胞因子分析PBMC產(chǎn)生IFN-測(cè)定取抗凝外周靜脈血 1mlPMA+Ionomysin 374hMonosin 37 2h收集細(xì)胞，洗滌，(表染)溶血、洗滌、固定破膜、胞內(nèi)細(xì)胞因子染色洗滌，加1%PFA，檢測(cè)管號(hào)熒光抗體1空白對(duì)照2同型對(duì)照IgG1-FITC3激活對(duì)照 CD69-FITC4未激活對(duì)照Anti-IFN-FITC5檢測(cè)組Anti-IFN-FITC9/13/2022369/13/202237Intracellular Cytokine-Protocol9/13/202238細(xì)胞周期分析-PI染色測(cè)細(xì)胞周期上機(jī), 檢測(cè)、分析獲取單細(xì)胞懸液，洗滌70%冷乙醇 4 2hRNase A 懸浮消化 30minPI 染液作用 4 30min篩網(wǎng)過濾管號(hào)熒光素1空白對(duì)照組 2檢測(cè)組 PI上機(jī)檢測(cè)9/13/2022399/13/202240細(xì)胞周期G1MG2SQuiescent cellsG09/13/202241A typical DNA HistogramG0-G1SG2-MFluorescence Intensity# of Events9/13/2022429/13/202243細(xì)胞早期凋亡分析-Annexin V/PI