生物樣品的常用分析方法課件

1、 體內(nèi)藥分專題之五 生物樣品常見分析方法思考 1.在體內(nèi)藥物分析中所采用的生物 樣品有哪些? 2.最常用的生物樣品是什么?3.藥物分析中常見分析方法包括哪些?哪些適用于體內(nèi)藥物分析? 生物樣品的常用分析方法 體內(nèi)藥物分析是借助于現(xiàn)代化的儀器與技術(shù)來分析藥物在體內(nèi)數(shù)量與質(zhì)量的變化，以獲得藥物在體內(nèi)的各種藥代動力學參數(shù)、代謝方式、代謝途徑等信息。目前，用于生物樣品分析的方法有很多，歸納起來主要有以下幾類： 生物樣品的常用分析方法 1. 色譜分析法 2. 光譜分析法 3. 免疫分析法 4. 微生物分析法 5. 電化學分

2、析法 com色譜法(chromatography) 色譜法(chromatography) 一種物理或化學的分離分析方法，其分 離原理主要是利用物質(zhì)在流動相和固定相中的分配系數(shù)，或吸附能力的差異而達到分離。 包括薄層色譜(TLC)，紙色譜(PC)，凝 膠色譜，氣相色譜(GC)和液相色譜(LC)。 薄層色譜法（thin layer chromatography ） 分離速度快 優(yōu)點 檢出靈敏度高 選擇性好 顯色方便等 缺點：對生物高分子分離效果不甚理想。 薄層掃描法 (TLCS)系指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄

3、層色譜中有紫外或可見吸收的斑點或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品的質(zhì)量檢查的方法。與高效液相色譜法相比，具有多通道效應(yīng)，可同時平行分離分析多個樣品；流動相用量少且選擇范圍寬、更換方便；固定相為一次性使用，對樣品的預(yù)處理要求不高等優(yōu)點。已成為薄層色譜常用的定量方法，在體內(nèi)藥物分析中廣泛應(yīng)用。 氣相色譜法 (gas chromatography，GC)定義：以氣體為流動相的的色譜法稱為氣相 色譜法。分類：按固定相的聚集狀態(tài)：GSC、GLC按分離原理：GSC屬于吸附色譜、GLC 屬于分配色譜按色譜操作形式：填充柱氣相色譜、毛

4、細管柱氣相色譜。優(yōu)點：1.效能高 neff可達103-106。2.靈敏度高 檢測限可達納克級或更低。3.選擇性高 固定相對性質(zhì)極為相似的組分，如烴類異構(gòu)體等有較強的分離能力。4.分析速度快 一般的氣相色譜分析一次僅需幾分鐘。5.應(yīng)用范圍廣 氣相色譜法廣泛應(yīng)用于氣體和易揮發(fā)性物質(zhì)或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)性物質(zhì)的生物樣品的定性和定量分析。 氣相色譜法 (gas chromatography，GC) 氣相色譜法 (gas chromatography，GC) 缺點：要求被測藥物及其代謝物必須具有一定的 揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性。解決方法

5、：固定相發(fā)展和衍生化試劑的廣泛使用，使生物樣品不再受限制。氣相色譜法(gas chromatography ，GC)結(jié)論: 該方法簡便、快速、準確，檢出限低，適合中毒病人血液中溴氰菊酯含量的測定。定義 高效液相色譜法優(yōu)點 以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，以微粒型填料作固定相，采用高壓送液泵和各種高靈敏度檢測器。 分離效能高檢測靈敏度高分析速度快 選擇性好 適用范圍廣分離方法 高效液相色譜法高效液相色譜法 主要根據(jù)是樣品的相對分子質(zhì)量的大小，在水中

6、和有機溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學結(jié)構(gòu)等物理、化學性質(zhì)。色譜分離方法的選擇高效液相色譜法一、相對分子質(zhì)量 對于相對分子質(zhì)量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進行分析 。 相對分子質(zhì)量在2002000的化合物，可用液-固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對分子質(zhì)量高于2000，則可用空間排阻色譜法。高效液相色譜法二、溶解度 水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液-液分配色譜法； 微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法； 油溶性樣品或相對

7、非極性的混合物，可用液-固色譜法。高效液相色譜法三、化學結(jié)構(gòu) 若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液-液分配色譜也都能順利地應(yīng)用于化合物；異構(gòu)體的分離可用液-固色譜法；具有不同官能團的化合物、同系物可用液-液分配色譜法；對于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。高效液相色譜法高效液相色譜法串聯(lián)紫外- 熒光檢測器同時測定人血漿中對乙酰氨基酚與鹽酸曲馬多的濃度為10.03 ng/ml，線性范圍為10.0340110 ng

8、/mL，日內(nèi)RSD為1.9% 5.9% ，日間RSD為3.4% 7.3%。受試制劑中對乙酰氨基酚的相對生物利用度為(96.1 15.0) % ，曲馬多的相對生物利用度為(93.9 15.3) %。結(jié)論:本方法操作簡便、靈敏度高，可用于臨床血藥濃度測定。受試制劑與參比制劑生物等效。 膠束電動毛細管色譜(MECC) 在MECC體系中存在著以膠束形式存在的準固定相和作為載體的液體流動相，膠束帶電荷在電場的作用下產(chǎn)生泳動，溶質(zhì)中各組分依據(jù)其在水相和膠束相之間的分配差異及在電泳和電滲流驅(qū)動下出現(xiàn)淌度差異而分離。優(yōu)點：手性拆分

9、常用的分離模式之一，只需在背景電解質(zhì)中添加手性選擇劑，構(gòu)建手性環(huán)境，即可進行手性拆分，本法適用于拆分人體內(nèi)的氨基酸。渦流色譜技術(shù)(TFC) 渦流色譜技術(shù)是利用大粒徑填料使流動相在高流速下產(chǎn)生渦流狀態(tài)，從而對生物樣品進行凈化與富集。優(yōu)點: 可以在線處理生物樣品，速度快、選擇性好、靈敏度高，易于實現(xiàn)自動化，近年來在生物領(lǐng)域尤其是體內(nèi)藥物分析中得到了廣泛的應(yīng)用。參考文獻：渦流色譜技術(shù)在生物樣品分析中的應(yīng)用劉朋，周建良，安婧婧，李萍，Chinese Journal of Chromatography1 光譜法(Spectroscopy) 光譜法是基于檢測能量（電磁輻射）作用于待測物質(zhì)后產(chǎn)生的輻射信號或

10、所引起的變化的分析方法。特點應(yīng)用于體內(nèi)藥物分析的光譜法 比色法（COL） 紫外分光光度法（UV） 熒光分析法（Fluorescence method） 原子吸收分光光度法（AAS）一.比色法（COL）屬于吸收光度法 定量依據(jù)-Lambert-Beer定律 A=ECL 物質(zhì)在一定波長處的吸收度與其濃度成正比。比色法僅用于少數(shù)藥物濃度高，干擾成分少的生物樣品的測定。主要用于藥物監(jiān)測和人群代謝分型的測定，逐漸被現(xiàn)代色譜分析方法所取代。紫外分光

11、光度法（UV） 原理同比色法。適用于測定具有紫外吸收的藥物。 體內(nèi)藥分中母體藥物與代謝物的紫外吸收光譜非常相似，易產(chǎn)生干擾。受靈敏度和選擇性的限制，其在體內(nèi)藥分中的應(yīng)用也呈下降趨勢。 熒光分析法（Fluorescence method） 利用物質(zhì)經(jīng)光照射后能發(fā)射熒光的特性進行分析的光學分析法。 優(yōu)點： 1.靈敏度高。檢出限可達10-10 g/ml10-12g/ml。 2.選擇性好。熒光分析法（Fluorescence method）1.直接測定法 適于自身能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，因熒光性質(zhì)與溶液的pH有關(guān)，故熒光強度的測

12、定須在適宜的pH介質(zhì)中進行。(一)常規(guī)熒光分析法2.間接測定法 將無熒光或弱熒光物質(zhì)衍生化，測定衍生物熒光強度的方法。熒光分析法（Fluorescence method）利用膠束溶液對熒光物質(zhì)的增溶、增敏和增穩(wěn)作用，大大提高熒光分析法的靈敏度和穩(wěn)定性。（二）膠束增溶增敏熒光分析法用-CD單分子膠束熒光技術(shù)檢測秦艽中龍膽苦苷血藥濃度。 龍膽苦苷嵌入-CD的疏水空洞中，使其在膠束中溶解度增加和相互碰撞幾率減少，熒光量子效率提高，從而提高檢測靈敏度。熒光分析法（Fluorescence method）（三）熒光探針分析法

13、 使用熒光探針從無熒光的藥物制備有熒光的衍生物。優(yōu)點1增強待分析物質(zhì)的熒光響應(yīng)，提高檢測靈敏度和選擇性。2穩(wěn)定分析物，尤其針對活潑的和有揮發(fā)性的化合物。3有助于化合物基團的確證。局限 衍生化增加分析步驟，易引入分析誤差。熒光分析法（Fluorescence method）示例 Tb-吡哌酸的熒光體系及尿和血清中吡哌酸含量的測定 應(yīng)用鑭系離子發(fā)光探針生成Tb-吡哌酸配合物，在紫外光照射下發(fā)生分子內(nèi)能量傳遞使Tb產(chǎn)生特征熒光，其熒光強度與吡哌酸濃度呈線性關(guān)系，從而建立一種靈敏、快速的分析吡哌酸的方法。4熒光分析法（Fluorescence method）（四

14、）熒光淬滅分析法 待分析的物質(zhì)能使某種熒光化合物的熒光淬滅，通過測量熒光化合物熒光的下降，間接測量該分析物質(zhì)。原子吸收分光光度法（AAS） 原子吸收分光光度法是基于蒸汽相中被測元素的基態(tài)原子對其原子共振輻射的吸收來測定樣品中該元素含量的一種方法。 原子吸收分光光度法在測定體液中微量金屬元素方面占有特殊的地位。原子吸收分光光度法（AAS）優(yōu)點： 靈敏度高，精密度好，選擇性好，應(yīng)用范圍廣，試樣用量少，簡便快速，易于自動化。局限性： 1.該法只能進行無機元素的含量分析，不能直接用于有機化合物的含量分析和結(jié)構(gòu)分析；2.每測

15、一種元素要更換一次空心陰極燈，不能同時進行元素分析；3.標準工作曲線的線性范圍窄，一般為一個數(shù)量級。原子吸收分光光度法（AAS）原子吸收分光光度計主要部件： 光源（空心陰極燈） 原子化器 單色器 檢測系統(tǒng)原子吸收分光光度法（AAS）ab吸收光譜儀光源單色器樣品檢測器讀出器件原子化器 單色器光電倍增管樣品空心陰極燈讀出器件原子吸收分光光度法（AAS） 直接測定法 石墨爐原子吸收法測定大鼠血清、尿、膽汁和組織中的順鉑 間接測定法 尿樣中氨基多糖含量的測定 www。themegal

16、免疫分析法放射免疫分析法 (radioimmunoassay) 原理:放射性標記抗原和未標記抗原（待測物）與不足量的特異性抗體競爭性地結(jié)合，反應(yīng)后分離并測量放射性而求得未標記抗原的量。用反應(yīng)式表示為： Ag + Ab=Ag-Ab + Ag* | Ag*-A放射免疫分析法 (radioimmunoassay)1靈敏度高2特異性強3取樣量少，適用于大批量樣品的測定優(yōu)點：放射免疫分析法 (radioimmunoassay)1需要用放射性同位素標記抗原，其放射性對操

17、作人員的健康、對環(huán)境的污染都會造成危害。2有時會出現(xiàn)交叉反應(yīng)、假陽性反應(yīng)。3需要有專用的同位素實驗室及免疫測定儀器。缺點：放射免疫分析法 (radioimmunoassay)應(yīng)用實例最典型的例子是：地高辛的血藥濃度測定酶免疫分析法 （enzyme Immunoassay）均相EIA 非均相EIA 酶免疫分析法均相EIA非均相EIA酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA） 原理： 將特異的抗原- 抗體免疫學反

18、應(yīng)和酶催化反應(yīng)相結(jié)合，以酶促反應(yīng)的放大作用來顯示初級免疫反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA） ELISA是通過在合適的載體上，酶標限定量抗原與未知抗原競爭固相抗體結(jié)合位點或固相抗原與未知抗原競爭限定量的標記抗體結(jié)合位點，形成抗體復(fù)合物。在一定底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底物，使其水解、氧化或還原成另一種帶色物質(zhì)。由于酶的降解底物與顯色是成正比的，通過肉眼觀察或分光光度計測定，從而確定是否存在未知抗原或含量。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）應(yīng)用實例：酶聯(lián)免疫分析法及其在食品農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用武中平，徐春祥等 酶免疫分

19、析法檢測肝腎胰島細胞移植患者術(shù)后CSA濃度的臨床評價 溫冬梅 ，梁劍平 ，吳劍楊 ，龐嘉琳 ，李曼 酶免疫分析法（enzyme Immunoassay）酶標記物是非放射性同位素，可避免對人體的放射性傷害和對環(huán)境的污染。酶標記物比較穩(wěn)定，半衰期可超過一年。反應(yīng)不需溫育，均相EIA不需分離直接測定。反應(yīng)可用可見-紫外分光光度法測定。4123EIA優(yōu)點：酶免疫分析法（enzyme Immunoassay）標記酶不能像同位素標記物和熒光標記物那樣直接產(chǎn)生信號，須有其他試劑（酶底物、輔酶）的參與，才能完成酶反應(yīng)。EIA缺點：

20、化學發(fā)光免疫分析（CLIA） 化學發(fā)光免疫分析（CLIA）是將高靈敏度的化學發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，借以檢測超微量物質(zhì)的一種分析技術(shù)?；瘜W發(fā)光免疫分析包含兩個部分，即化學發(fā)光系統(tǒng)和免疫反應(yīng)分析系統(tǒng)。 化學發(fā)光分析系統(tǒng)：經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化激發(fā) 態(tài)的中間體光子發(fā)光信號光量子 產(chǎn)額。 免疫反應(yīng)系統(tǒng)：類似于抗原與抗體 化學發(fā)光免疫分析（CLIA）按發(fā)光劑不同分為:1.直接化學發(fā)光物質(zhì)標記法（CLIA）發(fā)光劑直接標記抗體，多用吖啶酯類和苯酚類化合物。2.化學發(fā)光酶免疫分析法（CLEIA）以催化反應(yīng)的

21、酶為標記物，抗原抗體結(jié)合后，其中的酶可對發(fā)光體系產(chǎn)生催化作用，產(chǎn)生發(fā)光效應(yīng)。多用的發(fā)光體系是HRP-魯米諾。3.電化學發(fā)光免疫分析法（ECLIA）電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的Ag或Ab進行定量定性。 化學發(fā)光免疫分析（CLIA）高度敏感，可達pgml或pmol水平；特異性強，重復(fù)性好。測定范圍寬，可達7個數(shù)量級。試劑穩(wěn)定，無毒害，無污染，有效期長，達數(shù)月甚至數(shù)年。操作簡單，耗時短，易于自動化。在對環(huán)保很重視的國家，CLIA成了取代RIA的首選方法?；瘜W發(fā)光免

22、疫分析（CLIA）應(yīng)用實例呂干新、何偉珍等人化學發(fā)光免疫分析法測定地高辛血藥濃度結(jié)果分析鐘筑寧、谷俊瑩等人化學發(fā)光免疫分析法與放射免疫分析法測定性激素的評價熒光免疫分析FIA 是以熒光物質(zhì)作為標記物與待測藥物結(jié)合，所形成的熒光標記物能與抗體發(fā)生免疫反應(yīng) ，引起熒光強度發(fā)生變化的一種分析方法。 按產(chǎn)生熒光的方式不同 1.底物標記熒光免疫分析2.熒光偏振免疫分析3.熒光淬滅免疫分析4.熒光增強免疫分析5.時間分辨熒光免疫分析底物標記熒光免疫分析(FPLA) 用一種本身不能發(fā)出熒光的酶底物來標記藥物，當酶底物受到相應(yīng)酶作

23、用時，能裂解產(chǎn)生熒光，其熒光強度與待測藥物含量成正比。熒光偏振免疫分析( FPIA) 用一定波長的激發(fā)偏振光照射熒光物質(zhì)，然后利用物質(zhì)吸收光能后所發(fā)射出的偏振熒光強度來測定樣品中待測組分含量的一種分析方法。熒光偏振免疫分析( FPIA)熒光偏振免疫測定方法評價：樣品用量少熒光素標記試劑穩(wěn)定，使用壽命長重復(fù)性好快速，易自動化適于小、中等分子物質(zhì)檢測熒光偏振免疫測定方法評價靈敏度較非均相熒光免疫測定法低熒光偏振免疫分析( FPIA) 目前應(yīng)用最多的是FPIA，是一種新型的競爭性免

24、疫分析方法 ，相對于傳統(tǒng)的酶聯(lián)吸附免疫分析 (ELISA) ，F(xiàn)PIA是均相的反應(yīng)體系，不需要分離結(jié)合和未結(jié)合的抗體，其已在藥物檢測領(lǐng)域得到了初步應(yīng)用，主要用于測定藥物、激素等物質(zhì)，是用于治療藥物監(jiān)測的最新檢測技術(shù)。 熒光淬滅免疫分析FQIA 是利用游離標記藥物具有熒光，當其與抗體結(jié)合之后即失去熒光這一性質(zhì)來測定樣品含量的一種熒光分析方法。 熒光增強免疫分析FEIA 是利用熒光標記藥物與抗體結(jié)合之后，能使其熒光強度增強的性質(zhì)來測定樣品的含量。時間分辨熒光免疫分析TRFIA T

25、RFIA 技術(shù)是以鑭系元素為示蹤劑，用具有雙功能基團的鑭系元素標記抗原或抗體，當與抗體或抗原結(jié)合時，抗原抗體復(fù)合物在增強液中解離，在特定激發(fā)光激發(fā)下發(fā)出特定波長的熒光。用時間分辨熒光儀測定復(fù)合物中稀土離子發(fā)射的熒光強度，從而確定待測樣品中抗原或抗體的濃度值，以達到定量分析的目的。 時間分辨熒光免疫分析TRFIA 與以往的放射免疫分析法相比，鑭系元素具有以下特點：激發(fā)光譜帶寬，可以增加激發(fā)能，提高靈敏度；發(fā)射光譜帶窄，減少非特異熒光，可有效降低本底熒光，且能量損失也不大；鑭系離子鰲合物的熒光壽命很長，鑭系離子由激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)時發(fā)射熒光，在測量時間內(nèi)可反復(fù)激發(fā)鑭系離子，相當于大大提高了標記比活性

26、；標記物比較穩(wěn)定，可以保存1-2年。時間分辨熒光免疫分析TRFIA應(yīng)用舉例：李慧萍、段巧艷 時間分辨熒光免疫分析 法檢測乙型肝炎病毒血清標志物研究 國內(nèi)最常用的HBV感染者的血清學標志物檢測主要依靠酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），它只能對HBV 血清學標志物做定性或半定性分析，而且操作過程中受多種因素影響。ELISA 檢測結(jié)果準確度降低，時間分辨熒光免疫分析TRFIA甚至出現(xiàn)假陽性、假陰性結(jié)果。尤其目前ELISA 法不能用于定量測定，局限了其應(yīng)用。 TRFIA 靈敏度高，特異性強，對于乙型肝炎兩對半定量檢測，能夠準確、及時、靈敏地反映患者體內(nèi)的HBV 病毒標志物的含量。 微生物測定法（microbiological analysis，MA） 為生物檢定法，它是利用藥物（常為 抗生素）對于微生物的抑制或殺滅作用，通過選擇對藥物敏感的試驗菌，在適當?shù)臈l件下，根據(jù)培養(yǎng)基上所產(chǎn)生的抑菌圈的大小來測定藥物效價的方法。