甘薯糖蛋白的分離純化課件

1、甘薯糖蛋白的分離純化微生物09301班 第七小組程蒙 董雨 葉雷 崔德1糖蛋白的介紹2 甘薯糖蛋白的分離純化及鑒定34內(nèi)容結(jié)果分析及結(jié)論小結(jié)1908年美國生物化學(xué)家協(xié)會的蛋白質(zhì)命名委員會首次將糖蛋白定義為:由蛋白質(zhì)分子和除核酸外的包含有碳水化合物基團的物質(zhì)共同組成的一類復(fù)合物。現(xiàn)已將蛋白聚糖從糖蛋白中劃分出來，而專指由比較短且往往具分支的寡糖鏈與蛋白質(zhì)(多肽鏈)共價相連而構(gòu)成的糖復(fù)合物。一，糖蛋白的介紹甘薯糖蛋白SPG-1是一具O-型糖肽鍵的糖蛋白，所以其中的糖鏈SPG小P可在堿性條件下釋放，所釋放的糖鏈能被NaBH4場還原成對堿穩(wěn)定的糖醇，而SPG-1中的蛋白質(zhì)(肽鏈)也可部份被堿性降解為低

2、聚肽和氨基酸其糖鏈也有可能被部分降解為低聚糖和單糖。SPG-1-P的一級結(jié)構(gòu)是一種由葡萄糖形成的均多糖，為中性多糖。SPG-1-P主要是以-型糖苷鍵連接的，糖環(huán)為毗喃型。甲基化反應(yīng)證明SPG-1-P是以-1，6-連接的葡聚糖。 糖鏈結(jié)構(gòu)甘薯糖蛋白日本營養(yǎng)學(xué)家發(fā)現(xiàn),甘薯含有豐富的粘液蛋白,這是一種多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合的糖蛋白,對人體有特殊的保護作用,能保持消化道、呼吸道、關(guān)節(jié)腔、膜腔的潤滑和血管的彈性,由于這種物質(zhì)可防止脂類物質(zhì)在動脈管壁上沉積而引起的動脈硬化,防止肝及腎臟等器官結(jié)締組織的萎縮,可以減緩人體器官的老化,提高肌體免疫力。日本國力癌癥預(yù)防研究所通過實驗證明,甘薯的抗癌效果在各種蔬菜中位居

3、第1。我國是世界上甘薯生產(chǎn)第1大國,在甘薯淀粉生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的廢液，這其中就含有大量的甘薯糖蛋白。甘薯糖蛋白的利用（）國外甘薯食品的開發(fā)利用現(xiàn)狀目前，國外的甘薯食品有：方便食品、快餐食品、方便半成品，如薯米(粒)、薯粉、薯面、脫水薯片(條、泥)；休閑食品，如膨化薯片、薯脯等，這類食品具有味美、食用方便、包裝精美等特點；其他，如甘薯飲料、甘薯罐頭、甘薯酒等i引。近年來，國外一些地區(qū)掀起了一陣甘薯食品熱，一些較大的食品廠竟相丌發(fā)甘薯食品，使這種普通的甘薯成為人們喜好的新潮食品。目前它己被制作成山芋餅、小甜餅、果子凍、冰淇淋、果子露，甘薯酸奶等多種保健食品和美容食品。（）國內(nèi)甘薯食品的開發(fā)利用

4、現(xiàn)狀國內(nèi)利用甘薯加工的食品有：甘薯脯、甘薯蜜餞、甘薯醬、薯糕、軟糖、罐頭、粉絲、粉條、粉皮、甘薯粉、多維面條、煎餅、雪糕、巧克力、膨化食品、脫水甘薯片、蝦味脆片、速煮甘薯、冷凍甘薯片、連城紅心薯干、香酥薯片、甘薯發(fā)糕、甘薯點心、甘薯黃酒掣。目前，香港己流行用甘薯葉制作名宴菜，菜市出售每kg甘薯葉價超過100港元，且貨源奇缺，經(jīng)常脫銷。用甘薯葉加工成的脫水菜、鹽漬菜，在日本、歐美、東南亞等地市場非常暢銷。我國福建省的永定、新羅、安溪、永春等地及廣東省一些地區(qū)，也常以甘薯葉作為夏季蔬菜。甘薯葉食用方法簡單，取幼嫩的葉片與葉柄(撕去表皮)，經(jīng)開水燙熟后，佐以香油等調(diào)料即可入肴，也可加調(diào)料爆炒。儀器：

5、紫外可見分光光度計、SDS-PACE電泳儀、自動部分收集器、冷凍真空干燥器、離心機、層析系統(tǒng)、ZK-82A真空干燥箱2.甘薯粗糖蛋白提取的工藝路線為： 甘薯粉一熱水浸提一抽濾得到浸提液一浸提液真空濃縮一醇析過夜一離心棄上清一少量水溶解一Sevag法去除游離蛋白一離心一取水層透析一透析內(nèi)液醇析過夜一離心一沉淀真空干燥一甘薯粗糖蛋白，3.分離和純化的操作步驟 (1)稱取的甘薯在60下烘干并粉碎，加適量（46倍）水浸取3次，每次0.51h。 (2)合并浸取液，離心，上清液加無水乙醇沉淀蛋白，離心后分離出沉淀。 (3)所得沉淀物用適量蒸餾水溶解，再加入氯仿：正丁醇=4:1(V/V）的Sevag試劑，以

6、充分去除脂質(zhì)、游離蛋白質(zhì)，然后樣液取水層透析，收集透析袋內(nèi)液，離心（4500r/min）30min，取上清液，真空干燥后即得甘薯糖蛋白粗品（淡黃色粉末）(4)甘薯糖蛋白粗品依次經(jīng)DEAE - 纖維素52柱層析(1.6cmx20cm)，分別用0.05,0.1,0.5mol/L的碳酸氫鈉溶液分階段洗脫，收集洗脫液。(5)洗脫液在經(jīng)過Sephadex G-100柱層析(1.6cmx80cm),用0.02mol/LTris-HCL(pH7.2)洗脫，收集洗脫液X(2) SDS一聚丙烯酰胺凝膠(SDSPAGE)電泳對甘薯糖蛋白的純度鑒定甘薯糖蛋白粗品和經(jīng)DEAE-52柱層析、Sephadex G-100

7、柱層析后的甘薯糖蛋白純品同時進行SDS一聚丙烯酞胺凝膠電泳，分離膠濃度為15，濃縮膠濃度為6，電極緩沖液為pH83的TrisGlySDS溶液，用考馬斯亮蘭R250染色，脫色液為7冰乙酸。實驗發(fā)現(xiàn)如圖、圖，甘薯糖蛋白粗品經(jīng)電泳后，有兩條染色帶，而甘薯糖蛋白純品只有唯一的一條帶，可以證明甘薯糖蛋白純品已經(jīng)得到純化。圖甘薯糖蛋白粗品圖甘薯糖蛋白純品SDSPAGE電泳圖SDSPAGE電泳圖三、結(jié)果分析及結(jié)論甘薯糖蛋白提取料液比及時間的確定甘薯糖蛋白提取沉淀試劑的選擇透析對甘薯糖蛋白提取率的影響甘薯糖蛋白的純化結(jié)論從圖可以看出，隨溶劑體積的增加和提取時間的延長，提取率逐漸增大。當(dāng)提取溶劑大于6倍樣品體積

8、和提取時間大于lh后，提取率基本不變。故選擇溶劑為6倍樣品體積，提取時間lh為最佳提取條件。甘薯糖蛋白提取料液比及時間的確定甘薯糖蛋白提取沉淀試劑的選擇從圖可以看出，三種溶劑中，丙酮的沉淀作用最強1030乙醇、甲醇對甘薯糖蛋白沒有沉淀作用，但三種溶劑在90時達到相同的沉淀效果。考慮到生產(chǎn)成本，本實驗選擇無水乙醇為沉淀甘薯糖蛋白的溶劑透析對甘薯糖蛋白提取率的影響通過透析，分子量小于1000Da的小分子物質(zhì)被去掉。在透析過程中，觀察到透析袋內(nèi)樣品顏色變淡，而透析袋外液由無色轉(zhuǎn)為淡黃色。從圖可以看出，通過72h透析，估計原樣品中近50的雜質(zhì)被透析除去，經(jīng)檢驗，已有效除去還原糖、氨基酸等小分子組分。將

9、透析袋內(nèi)液真空干燥得淡黃色粉未即為甘薯糖蛋白粗品，可供柱層析純化。甘薯糖蛋白的純化用00507m01L的碳酸氫鈉溶液洗脫時，如表l，既改變了洗脫液的pH，又改變了離子強度，甘薯糖蛋白得到較好的分離。尤其在分段洗脫階段，當(dāng)碳酸氫鈉溶液濃度為005、01、05molL時，A490和A280值均較高，故O05、01、05molL的碳酸氫鈉可作為DEAE一52柱層析純化甘薯糖蛋白的適宜階段洗脫劑甘薯糖蛋白的純化DEAE52柱層析純化甘薯糖蛋白效果從圖4可以看出，在DEAE52纖維素層析柱上，甘薯糖蛋白粗品經(jīng)005、01、05mol/L的碳酸氫鈉溶液階段洗脫，得到1個洗脫峰，取此高峰部分透析干燥，得白色

10、粉末。 結(jié)論本文提出的室溫下水浸提，無水乙醇沉淀，sevag試劑脫蛋白、透析后經(jīng)DEAE一52柱層析、SephadexC100柱層析分離純化甘薯糖蛋白的流程，得到純度很高的甘薯糖蛋白。該流程能有效地純化甘薯糖蛋白，具有產(chǎn)物純度高、方法簡便、收率高等優(yōu)點，為我國資源豐富的甘薯找到了一條深加工途徑，另外為不同加工品種的選擇提供了依據(jù)。四小結(jié)，用有機溶劑乙醇沉淀法：具有沉淀作用強，沸點適中，無毒的優(yōu)點丙酮：介電常數(shù)小于乙醇，沉淀的能力較強，但沸點較低，揮發(fā)損失大，對肝臟有一定的毒性，著火點底。然而在操作過程中對溫度等蛋白質(zhì)沉淀的影響要求高，也要防止甘薯蛋白質(zhì)變性用法（氯仿：正丁醇:）來除去脂質(zhì)。游離蛋白質(zhì)等雜質(zhì)參考文獻【】孫冊，莫漢慶糖蛋白與蛋白聚糖結(jié)構(gòu)、功能和代謝M北京：科學(xué)出版社，1998【】張維杰復(fù)合多糖生化研究技術(shù)M上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1987【】田庚元，王晨，馮宇澄枸杞子糖蛋白分離純化、物化性質(zhì)及糖肽鍵特征J生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，1995，27(2)：20l一206【】王翎蟲花菌胞外糖蛋白的分離、純化及其性質(zhì)研究J真菌學(xué)報，1996，15(