四川省宜賓中學(xué)高二人教版生物選修一：5.3血紅蛋白的提取和分離課件

1、課題3 血紅蛋白的提取和分離 一、基礎(chǔ)知識：（一）蛋白質(zhì)提取和分離原理 （二）蛋白質(zhì)提取和分離的方法 1）凝膠色譜法：又稱分配色譜法 2）電泳法（三）緩沖液的作用二、實驗操作實驗步驟樣品處理和粗分離純 化純度鑒定 血液組成成分 1.洗 滌 紅 細(xì) 胞 2.釋放血紅蛋白 3.分離血紅蛋白 4.透析血紅蛋白二、實驗操作實驗步驟 血液組成成分 1.洗 滌 紅 細(xì) 胞 2.釋放血紅蛋白 3.分離血紅蛋白 4.透析血紅蛋白樣品處理和粗分離純 化純度鑒定蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù) 蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)差異： 1.分子的形狀、大小 2.電荷性質(zhì)和多少 3.溶解度 4.吸附性質(zhì) 5.對其他分子親和力 洗脫：從色譜

2、柱上端不斷注入緩沖液， 促使蛋白質(zhì)分子的差速流動?；旌衔锷?柱洗脫大分子流動快小分子流動慢收 集大分子收 集小分子 2凝膠電泳法：1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負(fù)電荷）、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。2）影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素電泳：帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程思考：蛋白質(zhì)為什么帶有電荷？在一定的PH下，蛋白質(zhì)可解離的基團會帶上電荷3）常用電泳方法 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙酰胺凝膠電泳 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大

3、小。 影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素決定運動方向電場作用力形成阻力決定運動速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等（4）緩沖溶液洗脫劑 作用： 配制：調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持 pH穩(wěn)定。 思考：如何配制不同PH值不同的緩沖液？1.洗 滌 紅 細(xì) 胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌的方法是什么？洗滌干凈的標(biāo)志是什么？血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2 min紅細(xì)胞血 漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色2.釋放血紅

4、蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？目的分析：蒸餾水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂20mmol/L磷酸緩沖液4.透析血紅蛋白透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血紅蛋白中的小分子雜質(zhì)純化凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5193.樣品的加入和洗脫步驟操作要求立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒蒸餾水充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計算稱量凝膠固定色譜柱材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75 20mmol/L磷酸緩沖液“G”表示什么？75代表什么？注意： 色譜柱不能內(nèi)不能有氣泡； 裝完后，立即用緩沖液洗滌，平衡凝 膠是凝膠裝填緊密3.樣品的加入和洗脫 1.調(diào)液面 2.加樣 3.再調(diào)液面 4.洗脫 5.收集緩沖液凝膠注意事項1. 紅細(xì)胞的洗滌： 洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。2.色譜柱的裝填： 裝填盡量緊密，降低顆