血清清蛋白、g-球蛋白的分離、提純與鑒定課件

1、南方醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心血清清蛋白、g-球蛋白的分離、提純與鑒定2009年秋季學(xué)期年秋季學(xué)期內(nèi) 容實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理2實(shí)驗(yàn)材料3實(shí)驗(yàn)過程45注意事項(xiàng)2009年秋季學(xué)期2一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄒ唬┱莆整}析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法（二）掌握凝膠層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法（三）掌握離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法（四）掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法（五）了解柱層析技術(shù)2009年秋季學(xué)期3二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)的分離和純化是研究蛋白質(zhì)化學(xué)及其生物學(xué)功能的重要手段。不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及等電點(diǎn)等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分離純化各種蛋白質(zhì)。2009年秋季

2、學(xué)期4 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與常用的分離純化方法蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)常用的純化方法分子質(zhì)量透析、超濾凝膠層析離心溶解度調(diào)整pH調(diào)整離子強(qiáng)度降低介電常數(shù)電荷電泳等電聚焦離子交換層析特異結(jié)合部位親和層析其他性質(zhì)吸附層析液相層析氣相層析2009年秋季學(xué)期51. 粗提（鹽析法）由于血清中各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣。調(diào)節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而達(dá)到分離的目的。血清清蛋白球蛋白半飽和硫酸銨清蛋白不沉淀，上清球蛋白沉淀，蒸餾水溶解2009年秋季學(xué)期72. 脫鹽（凝膠層析）鹽析分離的蛋白質(zhì)溶液中含有大量無機(jī)鹽，必須先脫鹽后才能進(jìn)一步純化脫鹽有多種方法，本實(shí)驗(yàn)采用凝膠層析

3、法凝膠層析法主要是根據(jù)混合物中各種物質(zhì)分子大小的不同而將其分離的技術(shù)2009年秋季學(xué)期83.純化（離子交換層析）離子交換層析是指流動(dòng)相中的離子和固定相上的離子進(jìn)行可逆的交換，利用化合物的電荷性質(zhì)及電荷量不同進(jìn)行分離R-SO3-H+ + Pr+R-SO3-Pr+ + H+陽離子交換陰離子交換R-N+R3OH- + Pr -R-N+R3Pr - + OH-2009年秋季學(xué)期100.06mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷清蛋白pI 4.9，帶負(fù)電荷多a、b球蛋白pI 5.05.2，帶負(fù)電荷少a、b球蛋白被洗脫,清蛋白仍被吸附0.02mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷清蛋白及a

4、、b球蛋白的pI6.5 ，帶負(fù)電荷g球蛋白pI 6.5，帶正電荷清蛋白及a、b球蛋白被層析柱吸附,g-球蛋白被洗脫0.3mol/LNH4Ac pH6.5DEAE帶正電荷緩沖液離子強(qiáng)度增加清蛋白被洗脫2009年秋季學(xué)期112009年秋季學(xué)期12三、實(shí)驗(yàn)材料人血清2009年秋季學(xué)期14四、實(shí)驗(yàn)過程鹽析（粗分離）葡聚糖凝膠層析（脫鹽）DEAE纖維素離子交換層析（純化）醋酸纖維素薄膜電泳（純度鑒定）2009年秋季學(xué)期15用1ml 0.0mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁, 離 子 交 換 柱 層 純 化除鹽后收集的清蛋白用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁, 取濃度最高

5、的1管作純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳法）繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液(3ml)洗脫磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液每管10d，連續(xù)收集3管DEAE-纖維素柱不用再生，可直接用于純化清蛋白除鹽后收集的球蛋白過DEAE-纖維素層析柱（1.06cm）過DEAE-纖維素層析柱（1.06cm）用約mL 0.06mol/L NH4AC緩沖液流洗，除去球蛋白和球蛋白用0.3mol/L NH4AC緩沖液(約3ml)洗脫磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有清蛋白的洗脫液每管10d，連續(xù)收集2管DEAE-纖維素柱先用6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH4AC溶

6、液流洗，再用10ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液流洗再生平衡離子交換柱再生和蛋白純度鑒定2管均作純度鑒定(醋酸纖維素薄膜電泳法)2009年秋季學(xué)期17醋酸纖維素薄膜電泳1. 點(diǎn)樣(粗面)8cm2cm點(diǎn)樣線點(diǎn)樣區(qū)1.5cm(粗面）點(diǎn)樣線盡量點(diǎn)得細(xì)窄而均勻,寧少勿多2009年秋季學(xué)期182. 電泳薄膜粗面向下點(diǎn)樣端置陰極端兩端緊貼在濾紙鹽橋上，膜應(yīng)輕輕拉平注意：切勿使點(diǎn)樣處與電泳槽接觸電壓：110V時(shí)間：50min。2009年秋季學(xué)期193. 染色和漂洗 電泳完畢后，關(guān)閉電源，將膜取出，直接浸于染色液中5min。 取出膜，盡量瀝凈染色液，移入漂洗液中浸洗脫色（一般更換2次），至背景顏色脫凈為止。 取出膜，用濾紙吸干即可。2009年秋季學(xué)期20五、注意事項(xiàng)所用血清應(yīng)新鮮，無沉淀物及細(xì)菌滋生。使用時(shí)勿將各時(shí)段所應(yīng)用的溶液濃度弄錯(cuò)。上樣時(shí)，滴管應(yīng)沿柱上端內(nèi)壁加入樣品，動(dòng)作應(yīng)輕、慢，勿將柱床沖起。流洗平衡時(shí)亦應(yīng)如此。洗脫時(shí)應(yīng)注意及時(shí)收集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失，并注意層析柱不要流干，進(jìn)入空氣。切勿將檢測(cè)蛋白質(zhì)的磺基水楊酸與檢查SO42-的BaCl2