DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀

1、DNA測序技術(shù)發(fā)展歷史與最新進(jìn)展主講人：鄧媛媛 李洋DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第1頁在4月，美國科學(xué)雜志 ，登載了一篇長達(dá)14頁論文尤其引人注目水稻（秈稻）基因組工作框架序列圖。 年12月，水稻基因組“精細(xì)圖”全部完成 DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第2頁12月10日，中國科學(xué)家在世界上率先完成家蠶基因組“框架圖”及基因組生物學(xué)分析結(jié)果在世界科學(xué)類權(quán)威學(xué)術(shù)期刊Science雜志上發(fā)表。 DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第3頁12月13日，Nature雜志登載了由深圳華大基因研究院領(lǐng)銜完成大熊貓基因測序。 DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第4頁為何要進(jìn)行DNA測序？DNA測序目標(biāo)就是為了認(rèn)識生命

2、本質(zhì)，了解生物差異性，以及不一樣生物進(jìn)化和發(fā)展歷史。DNA測序?qū)χ亟MDNA研究提供了方向。DNA測序在疾病診療和基因分型中有主要實(shí)用價值DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第5頁 DNA測序技術(shù)對象發(fā)展 自20世紀(jì)70年代DNA序列分析技術(shù)創(chuàng)造以來，人類對基因和基因組結(jié)構(gòu)研究和探索就沒有停頓過。 1977年測定了噬菌體X174基因組全部核苷酸序列。 當(dāng)前，已分析完成了大批生物全部基因組序列，包含噬菌體、病毒、細(xì)菌、酵母、多細(xì)胞真核生物、小鼠和人類。 年初完成人類基因組計(jì)劃使基因組研究到達(dá)了高潮，是人類真正認(rèn)識和自我改造開端。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第6頁第一代DNA測序技術(shù) 三測序方法原理第二

3、代DNA測序技術(shù) 三個測序平臺工作原理及操作步驟第三代DNA測序技術(shù) 單分子測序特點(diǎn)及應(yīng)用前景DNA測序技術(shù)歷史自沃森和克里克在1953年建立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，整個測序技術(shù)發(fā)展歷程。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第7頁第一代DNA測序技術(shù) 成熟DNA測序技術(shù)始于20世紀(jì)70年代中期。1977年Sanger創(chuàng)造了雙脫氧鏈終止法。同一時期, Maxam 和Gilbert報(bào)道了經(jīng)過化學(xué)降解測定DNA序列方法。 20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)熒光自動測序技術(shù)將DNA測序帶入自動化測序時代。這些技術(shù)統(tǒng)稱為第一代DNA測序技術(shù)。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第8頁 一，雙脫氧鏈終止法 原理：核酸模板在DNA聚

4、合酶、引物、4種dNTP 存在條件下復(fù)制時,在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按百分比引入4種雙脫氧核苷三磷酸( ddNTP) ,因?yàn)殡p脫氧核苷沒有3 -OH,所以只要雙脫氧核苷摻入鏈末端,該鏈就停頓延長,若鏈端摻入單脫氧核苷,鏈就能夠繼續(xù)延長。如此每管反應(yīng)體系中便合成以各自雙脫氧堿基為3端一系列長度不等核酸片段。反應(yīng)終止后,分4個泳道進(jìn)行凝膠電泳,分離長短不一核酸片段,長度相鄰片段相差一個堿基。經(jīng)過放射自顯影后,依據(jù)片段3端雙脫氧核苷,便可依次閱讀合成片段堿基排列次序。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第9頁 二，化學(xué)降解法 在該方法中,一個末端被放射性標(biāo)識DNA片段在5組相互獨(dú)立化學(xué)反應(yīng)中分別被部分降解,其

5、中每一組反應(yīng)特異地針對某種堿基。生成5組放射性標(biāo)識分子,每組混合物中均含有長短不一DNA分子,其長度取決于該組反應(yīng)所針正確堿基在原DNA片段上位置。最終,各組混合物經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,再經(jīng)過放射自顯影來檢測末端標(biāo)識分子。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第10頁 三，熒光自動測序技術(shù)熒光自動測序技術(shù)基于Sanger原理，用四種不一樣熒光混合物分別標(biāo)識四種反應(yīng)產(chǎn)物，用四種反應(yīng)物混合在一起進(jìn)行電泳，在激光激發(fā)下四種帶有不一樣熒光染料標(biāo)識物ddNTP能夠在同一反應(yīng)管種進(jìn)終止測序反應(yīng)，并于變性聚丙烯酰胺凝膠同一泳道中進(jìn)行電泳檢測。當(dāng)帶有某種熒光素標(biāo)識DNA片段電泳到激光探頭檢測范圍時，激光所激

6、發(fā)熒光信號被探測器接收，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)，自動排列出DNA序列。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第11頁第一代測序法比較 方法雙脫氧末端終止法 化學(xué)降解法熒光自動測序技術(shù) 優(yōu)點(diǎn)操作簡便，結(jié)果清楚可靠，一次能確定300-500個核苷酸序列，已成為最慣用DNA測序方法不需要進(jìn)行酶促反應(yīng)，能夠分析甲基化等DNA修飾情況自動化程度高，高效率，準(zhǔn)確度增加 缺點(diǎn)花費(fèi)時間過久，成本較高一次最多只能分析250個核苷酸 ，所用許多化學(xué)試劑有毒純化量小，不能純化較長片段DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第12頁第二代DNA測序技術(shù) 羅氏454 企業(yè)GS FLX測序平臺 Illumina 企業(yè)Solexa Genome

7、Analyzer測序平臺 ABI企業(yè)SOLiD測序平臺 二代測序關(guān)鍵思想是邊合成邊測序，即經(jīng)過捕捉新合成末端標(biāo)識來確定DNA序列。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第13頁 一、GS FLX測序技術(shù)原理1.樣品輸入并片段化：GS FLX系統(tǒng)支持各種不一樣起源樣品，包含基因組DNA、PCR產(chǎn)物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。2.文庫制備：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，將A和B接頭（3和5端含有特異性）連接到DNA片段上。接頭也將用于后續(xù)純化，擴(kuò)增和測序步驟。含有A、B接頭單鏈DNA片段組成了樣品文庫。3.一個DNA片段一個磁珠：單鏈DNA文庫被固定在尤其設(shè)計(jì)DNA捕捉磁珠上。每一個磁珠攜帶了一

8、個獨(dú)特單鏈DNA片段。磁珠結(jié)合文庫被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水混合物，這么就形成了只包含一個磁珠和一個獨(dú)特片段微反應(yīng)器4.乳液PCR擴(kuò)增：每個獨(dú)特片段在自己微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立擴(kuò)增，而沒有其它競爭性或者污染性序列影響。整個片段文庫擴(kuò)增平行進(jìn)行。對于每一個片段而言，擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個相同拷貝。隨即，乳液混合物被打破，擴(kuò)增片段依然結(jié)合在磁珠上。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第14頁5.一個磁珠一條讀長：攜帶DNA捕捉磁珠隨即放入PTP板中進(jìn)行后繼測序。PTP孔直徑（29um）只能容納一個磁珠（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，測序開始。放置在四個單獨(dú)試劑瓶里四種堿基，依照T、A、C、G

9、次序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個堿基。假如發(fā)生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶作用下，經(jīng)過一個合成反應(yīng)和一個化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最終將螢光素氧化成氧化螢光素，同時釋放出光信號。此反應(yīng)釋放出光信號實(shí)時被儀器配置高靈敏度CCD捕捉到。有一個堿基和測序模板進(jìn)行配對，就會捕捉到一分子光信號；由此一一對應(yīng)，就能夠準(zhǔn)確、快速地確定待測模板堿基序列。這也就是大名鼎鼎焦磷酸測序。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第15頁 一、GS FLX測序技術(shù)優(yōu)點(diǎn) GS FLX系統(tǒng)測序也是一個依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析新技術(shù)。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶協(xié)同作用下，

10、將優(yōu)點(diǎn)引物上每一個dNTP 聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來。經(jīng)過檢測熒光信號釋放有沒有和強(qiáng)度，就能夠到達(dá)實(shí)時測定DNA序列目標(biāo)。此技術(shù)不需要熒光標(biāo)識引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳； 特點(diǎn)：分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和自動化。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第16頁 Solexa測序技術(shù)路線：Genome Analyzer系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測序（Sequencing By Synthesis）原理。加入改造過DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)識dNTP。 這些核苷酸是“可逆終止子”，因?yàn)?羥基末端帶有可化學(xué)切割部分，它只允許每個循環(huán)摻入單個堿基。此時，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)

11、所聚合上去核苷酸種類。之后，將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸。這么，統(tǒng)計(jì)每輪搜集到熒光信號結(jié)果，就能夠得知每個模板DNA片段序列。當(dāng)前配對末端讀長可到達(dá)250 bp，更長讀長也能實(shí)現(xiàn)，但錯誤率會增高。讀長會受到多個引發(fā)信號衰減原因所影響，如熒光標(biāo)識不完全切割。4. 數(shù)據(jù)分析DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第17頁Solexa測序技術(shù)特點(diǎn)通量高。當(dāng)前一臺機(jī)器在兩周內(nèi)最高可產(chǎn)出360G 數(shù)據(jù);準(zhǔn)確率高。98. 5% ，同時也有效地處理了多 聚重復(fù)序列讀取問題;成本低。低于傳統(tǒng)Sanger 測序技術(shù)成本1% ;DNA 序列讀取長度不停增加，當(dāng)前單條序列讀長可到達(dá)150 bp;能夠

12、進(jìn)行Pair-end( PE) 雙向測序，PE 文庫插入片段大小范圍可由150 bp 到10 kb。正確選擇插入片段長度有利于高重復(fù)序列含量基因組組裝，這深入擴(kuò)展了該技術(shù)應(yīng)用范圍。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第18頁ABI測序技術(shù)ABI 3730XL測序原理ABI 3730 xl常規(guī)測序平臺采取毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該企業(yè)專利四色熒光染料標(biāo)識ddNTP(標(biāo)識終止物法)，所以經(jīng)過單引物PCR測序反應(yīng)，生成PCR產(chǎn)物則是相差1個堿基3末端為4種不一樣熒光染料單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而防止了泳道間遷移率差異影響，大大提升了測序

13、準(zhǔn)確度。因?yàn)榉肿哟笮〔灰粯樱诿?xì)管電泳中遷移率也不一樣，當(dāng)其經(jīng)過毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時，激光檢測器窗口中CCD(charge-coupled device)攝影機(jī)檢測器就可對熒光分子逐一進(jìn)行檢測，激發(fā)熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不一樣堿基信息不一樣顏色熒光，并在CCD攝影機(jī)上同時成像，分析軟件可自動將不一樣熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而到達(dá)DNA測序目標(biāo)。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列次序等各種形式輸出。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第19頁 # 三種第二代測序技術(shù)對比 #測序技術(shù)454SolexaSOLiD上市時間價格（萬美元，）504559單次反應(yīng)數(shù)據(jù)量0.42050讀長（bp）

14、40010050優(yōu)勢長讀長低測序成本，高性價比高通量，高準(zhǔn)確度DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第20頁第三代DNA測序技術(shù) 第二代測序技術(shù)在制備測序文庫時候都需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，而這一PCR過程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子百分比關(guān)系。另外，第二代測序讀長普遍偏短，在進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接時會碰到麻煩。為了克服這么缺點(diǎn)，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實(shí)時測序和納米孔為標(biāo)志第三代測序技術(shù)。 DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第21頁 1. Helicos企業(yè) Heliscope單分子測序儀基于邊合成邊測序思想，將待測序列隨機(jī)打斷成小片段并在3末端加上Poly(A)，用末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上Cy3熒光標(biāo)識。用小片段與

15、表面帶有寡聚Poly(T)平板雜交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5熒光標(biāo)識dNTP進(jìn)行DNA合成反應(yīng)，每一輪反應(yīng)加一個dNTP。 將未參加合成dNTP和DNA聚合酶洗脫。 檢測上一步統(tǒng)計(jì)雜交位置上是否有熒光信號，假如有則說明該位置上結(jié)合了所加入這種dNTP。用化學(xué)試劑去掉熒光標(biāo)識，方便進(jìn)行下一輪反應(yīng)。經(jīng)過不停地重復(fù)合成、洗脫、成像、淬滅過程完成測序。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第22頁 2. Pacific Biosciences企業(yè) Pacific Biosciences企業(yè)SMRT技術(shù)基于邊合成邊測序思想，以SMRT芯片為測序載體進(jìn)行測序反應(yīng)。SMRT芯片是一個帶有很多ZMW孔厚度為10

16、0 nm金屬片。將DNA聚合酶、待測序列和不一樣熒光標(biāo)識dNTP放入ZMW孔底部，進(jìn)行合成反應(yīng)。與其它技術(shù)不一樣是，熒光標(biāo)識位置是磷酸基團(tuán)而不是堿基。當(dāng)一個dNTP被添加到合成鏈上同時，它會進(jìn)入ZMW孔熒光信號檢測區(qū)并在激光束激發(fā)下發(fā)出熒光，依據(jù)熒光種類就能夠判定dNTP種類。另外因?yàn)閐NTP在熒光信號檢測區(qū)停留時間（毫秒級）與它進(jìn)入和離開時間（ 微秒級） 相比會很長，所以信號強(qiáng)度會很大。其它未參加合成dNTP因?yàn)闆]進(jìn)入熒光型號檢測區(qū)而不會發(fā)出熒光。在下一個dNTP被添加到合成鏈之前，這個dNTP磷酸基團(tuán)會被氟聚合物（fluoropolymer）切割并釋放，熒光分子離開熒光信號檢測區(qū)。DNA測

17、序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第23頁3. Oxford Nanopore Technologies企業(yè) Oxford Nanopore Technologies企業(yè)正在研究納米孔單分子技術(shù)是一個基于電信號測序技術(shù)。他們設(shè)計(jì)了一個以-溶血素為材料制作納米孔，在孔內(nèi)共價結(jié)合有分子接頭環(huán)糊精。用核酸外切酶切割ssDNA時，被切下來單個堿基會落入納米孔，并和納米孔內(nèi)環(huán)糊精相互作用，短暫地影響流過納米孔電流強(qiáng)度，這種電流強(qiáng)度改變幅度就成為每種堿基特征。DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第24頁 中國機(jī)構(gòu)主要負(fù)擔(dān)和參加已完成動植物基因組測序項(xiàng)目 物種 國內(nèi)主要負(fù)擔(dān)機(jī)構(gòu) 人 中國科學(xué)院華大基因研究中心等 水稻 中國科

18、學(xué)院華大基因研究中心等 家蠶 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國科學(xué)院北京基因組研究所和 華大基因研究中心等 家雞 中國科學(xué)院北京基因組研究所和華大基因研究中心等 人 深圳華大研究院等 血吸蟲 南方基因中心等 黃瓜 深圳華大研究院等 大熊貓 深圳華大研究院等 螞蟻 深圳華大研究院等DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀第25頁總結(jié)與展望三代測序技術(shù)原理各有特點(diǎn)，適用范圍也不近相同。第一代測序技術(shù) 憑借其長序列片段和高準(zhǔn)確率，適合對新物種進(jìn)行基因組長距框架搭建以及后期GAP填補(bǔ)，不過成本昂貴，而且難以勝任微量DNA樣品測序工作。第二代測序技術(shù)中，454序列片段最長，比較適合對未知基因組從頭測序，搭建主體結(jié)構(gòu)，不過在判斷連續(xù)單堿基重復(fù)區(qū)時準(zhǔn)確度不高。Solexa較454具有通量高、片段短、價位低特點(diǎn)，可以用于大基因組和小基因組測序和重測序。Solexa雙末端測序(paired-end sequencing)可認(rèn)為基因組深入拼接提供定位信息，不