DB12-T358-2008愛德華氏菌病診斷規(guī)程

1、ICS65.150B50 備案號：DB12DB12/T 3582008愛德華氏菌病診斷規(guī)程Standard method for diagnosing Edwardsiellosis in fish2008-02-19發(fā)布2008-03-30 實施天蓮市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB12/T 3582008本標(biāo)準(zhǔn)的編寫以GB/T 1.1 -2000的編制耍求為指南。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、B、C、D為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由大津市水產(chǎn)局嘩出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：犬津市水產(chǎn)研究所本標(biāo)準(zhǔn)主筆起草人：馮亍明、李軍、 本標(biāo)準(zhǔn)T2Q08年 月首汶發(fā)布。王菁、楊凱、馬文婷、干.玉佩。愛德華氏菌病診斷規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定 和結(jié)果判

2、定。本標(biāo)準(zhǔn)適用類（包括：親魚、成魚和魚苗）的該病診斷。了魚類愛徳華氏歯病診斷規(guī)程的診斷方法及所需的儀器、試劑、材料、設(shè)備、操作步驟丁天津地區(qū)養(yǎng)殖及門然魚類愛德華氏菌病診斷，也適用丁天津地區(qū)與其它地區(qū)間流通魚2規(guī)范性引用殳件卜.列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的 修改單（不包插勘誤的內(nèi)容） 是否可使用這烏文件的最新阪本。凡是不注日期的引用文件，其最浙版本適用丁本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T4789.GB/T 4789.GB/T 4789.GB 6682-GB/T 15805.1-1995 淡GB/T 18088-2000 出入水產(chǎn)動物病害學(xué)戰(zhàn)土斌主編，北京：中

3、國農(nóng)業(yè)出版社，2004,第一版伯杰細菌鑒定手冊或修訂版均不適用丁本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達成協(xié)議的務(wù)方研究7-2003食哋衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗副溶血.性弧菌檢驗28-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗染色法、培養(yǎng)基和試劑30-2003 食1992分析實4品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗單核細胞增生李斯特氏歯檢驗 !僉室用水規(guī)格和試驗方法水魚類檢疫方法第一部分、境動物檢疫采樣第8版，北京：北京科學(xué)出版社，19883儀器、試劑部材料3. 1設(shè)備和儀器生物顯微銳（貝油鏡利H 水生動物檢疫厲用的常規(guī)儀希和設(shè)備。3.2培養(yǎng)基和若非注明，3.3實驗室用按照GB/T音視野）、超凈作臺、恒溫干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿和接種環(huán)，以

4、及式劑本標(biāo)準(zhǔn)使用的認為分析純的試劑，培養(yǎng)基和試劑的配制方法見附錄A （規(guī)范性附錄）。 水5682-1992標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定執(zhí)行。4操作步驟4.1采樣按GB仃18 的個體。4.2臨床病理4.2.1外部癥388 2000標(biāo);隹的規(guī)定執(zhí)行。對有癥狀的魚類進行采樣，挑取不少丁尾癥狀明顯的瀕死觀察 狀觀察按照水產(chǎn)動物病害學(xué)的方法進行操作。將待檢魚放到白色解剖盤中，仔細觀察魚體表、鰭、眼 睛、口及鯉等， 4.2.2內(nèi)部解記錄癥狀。剖觀察DB12/T 35820082按照 GB/T 15805.1-1995開腹腔，剝離I 形成，記錄觀純化及鑒定前剪成弧形，打 觀察是否有腹水4.3病原分萬、4. 3. 1病原分鶴按

5、照 GB/T 15805.1-1995標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進行操作。用剪刀從肛門處向前剪開腹部，然后沿背部從后至 內(nèi)臟各器官，仔細觀察魚的肝、膽、脾、腸、腎筈器官的顏色、質(zhì)地，并 !察結(jié)果。盤中，用75%酒用灼燒炙熱的斛標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進行操作。在超凈.作臺中，將魚放到用75%酒精消毒的解剖 體表，按照4.2.2的方法打開腹腔，露出腎臟，酒精棉球擦拭腎臟表面后，精棉球擦拭魚剖刀灼燙腎表面，使腎臟出現(xiàn)白色灼面，將接種環(huán)從灼面處刺入腎臟挑取少許腎組織, 在SS瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種。4. 3.2純化培梟倒置SS瓊脂培養(yǎng)基平皿，周邊透明的露滴狀。將該形咨歯落轉(zhuǎn)接到普通瓊脂培養(yǎng)基平板上進一步分離純化培養(yǎng)，其在普通瓊脂培

6、 養(yǎng)基上會形成較小的灰冃色、4.3.3病原菌招態(tài)觀察4. 3. 3. 1菌體攔動性觀察按照GB/T789.30-200,標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進行操作。在滅閩的載玻片上加一滴無歯水，接種環(huán)挑取待檢 菌苔少許，涂抹在水滴中，力4. 3. 3. 2菌體段色特性與形按照GB/T I4789.7-2003 檢歯苔少許涂九，干燥后他nin,水洗，“山脫色液脫色至酒精剛不出現(xiàn)藍紫色為出，然后用【V液染1 mi倍觀察染色特主化鑒定酶試驗200。標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進行操作。用滅歯的接種環(huán)挑取分離純化的待檢鹵涂丁氧化酶 紙片上，15 s后觀察結(jié)果。發(fā)酵試驗 O-F）試驗2003標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進行操作。將純化的待檢菌接種到O-F生化管中

7、，加滅由的液監(jiān)笆恒溫培養(yǎng)24 h后，愛徳華氏菌在SS瓊脂培養(yǎng)基上的典塑閑落旱中央黑、有光澤的圓形菌落。用II染液染色1 光學(xué)顯微鏡4004. 3. 4病原菌4. 3. 4. 1 氧化按照GB/T口滅歯的蓋玻片用400倍的暗視野顯微鏡觀察菌體運動形態(tài)。態(tài)觀察標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進行操作。在滅歯的載玻片上加一滴無菌水，用接種環(huán)挑取待 焰上通過3次4次熱固定，滴加革蘭氏染液，用I染液染色Imin,水洗， 水洗。min,性和形態(tài)。4. 3. 4. 2 氧化按照GB/T體孔蠟覆蓋培*基液面，然后將生化管置無歯培養(yǎng)皿內(nèi)，35C培養(yǎng)24 h48 h后觀察結(jié)果。4. 3. 4. 3 腸桿按照伯素細歯鑒定手冊第8版進行。

8、用滅歯的接種環(huán)挑取普通瓊脂培養(yǎng)基上28C培養(yǎng)18 h24 h的歯苔少許，枸椽酸鹽、尿奉、半固體、和萄糖產(chǎn)氣、賴氨酸、鳥氨酸、棉于糖、山梨醇、側(cè)金盞花韓、木膠糖中， 進行15項生化京應(yīng)。生化試驗函件為：產(chǎn)氣曲驗在三糖鐵斜面培養(yǎng)基上觀察；賴氨酸、鳥氨酸生化管及對照管中加入滅 鹵液體石蠟覆*培養(yǎng)基液面 養(yǎng)18 h24 h后，向苯丙氨庫生化管中加入苯丙氨酸試劑后立即觀察結(jié)果，向蛋冃月東水生化管中加入靛 基質(zhì)試劑1滴S滴，輕輕搖気并觀察結(jié)果；35C培養(yǎng)24h48h后，向葡萄糖酸鹽生化管中加入葡萄糖 酸鹽試劑1滴，min 20 min后將全部反，的相應(yīng)編碼，鑒定管使用說菌科細菌生巾編碼鑒定管（GYZ-15

9、e）生化試驗分別加入生化鑒定管，包括：硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白腺水、葡磷腺水、石蠟高約0.5 cm,然后置滅鹵平皿內(nèi)，35C培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果；35C培煮沸中水育3觀察結(jié)果。應(yīng)結(jié)果記錄在 得到一個5位*字 明，并嚴(yán)格按min后觀察結(jié)果；向葡磷月東水生化管中加入MR試劑1滴2滴，置35C培養(yǎng)10鑒定單上見附錄B （規(guī)范性附錄），并按照所示的方法記取由反應(yīng)結(jié)果得出 ，査檢索編碼表，便可得到鑒定結(jié)果。使用前應(yīng)詳細閱讀細歯生化微量 要求操作。5結(jié)果判定DB12/T 35820085. 1臨床病理觀察結(jié)果判定5. 1. 1外部癥狀觀察結(jié)果判言 愛德華氏関出血、肛門紅腫要外部癥狀為：腹部膨脹

10、，有的病魚眼球冃濁或突起，體表有不同程度的 :部及兩側(cè)發(fā)生大面積潰瘍。病患病魚的主,嚴(yán)重的魚腹5. 1.2內(nèi)部解剖觀察結(jié)果判月病患病魚的土耍內(nèi)部癥狀為：肝、脾、腎一般表現(xiàn)為不同程度的腫脹、退色，尤以腎腫 的病魚膽囊腫大，腸道發(fā)炎；多數(shù)病魚有腹水，腹水F.無色或淡黃色膠水狀。愛徳華氏鹵大最為嚴(yán)重；有 5.2病原菌形態(tài)觀察結(jié)果判戸病原歯形態(tài)觀察結(jié)果判總依據(jù)附錄C（規(guī)范性附錄）。5. 3病原菌生化鑒定結(jié)果判定5. 3. 1氧化酶*驗結(jié)果判定氧化酶試驗陽性為紫紅色，陰性為無色或淡黃色。腸桿曲科的細歯應(yīng)為氧化酮陰性。腸桿閔科的細歯應(yīng)為發(fā)酵型代謝。為發(fā)酵型細菌，否則不是。5.3.2氧化一發(fā)酵試驗（O-F）

11、試驗結(jié)果判定 如O-F生化管變黃色，則5. 3.3腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管（GYZ-15e）生化試驗結(jié)果判定 病原歯生化試驗結(jié)果判定依據(jù)附錄D（規(guī)范性附錄）。5.4綜合判定采用本標(biāo)準(zhǔn)診斷方法同時獲得5.1、5.2、5.3二條所規(guī)定的全部診斷結(jié)果，可確診為愛徳華氏菌病。DB12/T 3582008 A. 1 SS瓊脂培養(yǎng)基:制東 牛肉粉 乳糖 硫代硫酸鈾 二號膽鹽 枸椽酸鈾j 枸椽酸鐵 瓊脂粉 中性紅 煌綠 蒸饞水PH混勻后加別煮沸溶解,5g5g10g8.5 g8.5 g8-5 g1.0 g15g0.025 g0.00033 g1000 ml7.0A.2革藍氏染液:附錄A（規(guī)范性附錄）試劑配制

12、待培養(yǎng)基稍涼后傾注滅歯平皿，凝固后備用。（也可百接購置商品）1、結(jié)品紫酒精飽利液2d ml, 1%草酸餃水溶液80 ml混合;碘化鉀2 g溶解在300 ml蒸餡水中; 精（醫(yī)用）；II、碘 1 g、III、95%酒IV、2.5%汁黃酒精溶液10 ml,加蒸餡水90 ml。A. 3生化鑒定試劑按照GB/T 4789.28-2003執(zhí)行。附錄B（規(guī)范性附錄）腸桿甘科細菌生化編碼鑒定管（GYZ-15e系統(tǒng)）鑒定單表B. 1試驗硫化氫苯 丙 氨 酸葡 萄 糖 酸 鹽東葡 磷 月東 水枸 椽 酸 鹽尿素K 1古1 體葡 萄 糖 產(chǎn) 氣賴氨酸氨酸棉于糖山 梨 醇側(cè) 金 盞 花木膠糖結(jié)果單值421421421421421總值注：1、結(jié)身2、單隹3、總隹,按反應(yīng)的結(jié)5,將町性反倒,依生化反應(yīng)G1分為陰性“一”和陽性“ + ” Oj 劃 1:0。:;的回性數(shù)值，單值累加并列1.一起。附錄C（規(guī)范性附錄）遲緩愛德華氏菌的判定表C. 1名稱創(chuàng)菌在SS瓊脂培養(yǎng)基上閑落 開，態(tài)菌體運動情況革藍氏染色遲緩愛徳4:氏曲#央黑，周邊透明的露滴狀 ，落菌體為短桿狀，周毛南，可運 動，歯體人小為0.5卩ml卩m X 1 卩 m 3（im。陰性DB