發(fā)酵工程韋革宏楊祥節(jié)

1、第五章 發(fā)酵工程的滅菌與空氣除菌設備、基質和空氣的凈化第一頁，共六十九頁。第一節(jié) 常見滅菌方法 化學、輻射和熱滅菌第二頁，共六十九頁。概述滅菌的概念：滅菌 (sterilization)即“失去繁殖能力”的意思，是指采用化學或物理的方法殺滅或去除物料及設備中一切有生命的有機體的過程。與滅菌相近的幾個概念滅菌與殺菌 (除菌)殺菌：殺死微生物后，其軀殼仍存在。溶菌：殺死微生物并使其細胞軀殼溶解、消失。除菌：從體系中去除微生物細胞。比較第三頁，共六十九頁。概述工業(yè)生產(chǎn)中常用的滅菌方法：化學滅菌射線滅菌干熱滅菌濕熱滅菌過濾介質除菌第四頁，共六十九頁。一、化學滅菌概念：化學滅菌指用化學藥品直接作用于微生

2、物抑制其增殖或將其殺死的方法。滅菌劑：迅速殺死體系表面和內(nèi)部所有微生物。消毒劑：只殺死體系 (主要是表面)中的病原微生物。防腐劑：抑制體系 (主要是食品)表面和內(nèi)部微生物的生長繁殖。注意：抑菌和殺菌甚至溶菌作用是相對的。第五頁，共六十九頁。一、化學滅菌常用的化學藥劑主要有石碳酸、甲醛、氯化汞、碘酒、酒精高錳酸鉀等。共同規(guī)律：殺菌強度有別，但在低濃度時都有促進微生物生長的刺激作用，在濃度升高后依次表現(xiàn)出制菌、殺菌和溶菌的現(xiàn)象。常見化學殺菌劑及其作用機制和應用范圍 在發(fā)酵工業(yè)上的應用不用于培養(yǎng)基滅菌第六頁，共六十九頁。一、化學滅菌環(huán)境消毒：生產(chǎn)車間、無菌操作間器械即手表面消毒：接種器械、取樣器械等

3、使用方法浸泡、擦拭、添加、噴灑、氣態(tài)熏蒸等 第七頁，共六十九頁。二、射線滅菌概念：射線滅菌是利用紫外線、高能電磁波或放射性物質產(chǎn)生的射線進行滅菌的方法。幾種放射性射線紫外線滅菌波長為253.7 nm的紫外線殺菌作用最強。機理：破壞核酸、形成活性自由基。穿透力差，一般用于環(huán)境和物體表面滅菌。滅菌效果：與距離、時間、微生物等有關。第八頁，共六十九頁。三、干熱滅菌 熱滅菌的分類干熱空氣滅菌設備：電熱干燥箱條件：160條件下保溫12 h。注意：滅菌物品用紙包扎或帶有棉塞時不能超過170。使用：玻璃和金屬器具。 第九頁，共六十九頁。四、濕熱滅菌濕熱滅菌是利用飽和水蒸汽冷凝時釋放的大量穿透力極強的潛熱使微

4、生物細胞中的蛋白質、酶和核酸分子受到不可逆破壞的滅菌方法。條件：121維持2030min。設備：各種高壓蒸汽滅菌器應用：非常廣泛，是發(fā)酵工業(yè)的主要滅菌手段。第十頁，共六十九頁。第二節(jié) 培養(yǎng)基與發(fā)酵設備的滅菌 原理和工藝第十一頁，共六十九頁。一、濕熱滅菌的基本原理 微生物的耐熱性溫度與微生物生長的關系微生物熱死原因體內(nèi)的一些重要蛋白質發(fā)生凝固、變性。致死溫度和致死時間能夠殺死微生物細胞的某一最低溫度稱致死溫度。在致死溫度以上的某個溫度殺死全部微生物細胞所需的時間稱為致死時間。熱滅菌效率的衡量TDP、TDT、D值、z值和F值第十二頁，共六十九頁。一、濕熱滅菌的基本原理微生物的熱阻熱阻指在某一特定條

5、件下 (主要是指溫度和加熱方式等) 微生物細胞的致死時間，表征了不同微生物細胞對熱的相對抵抗力。 例如一些微生物的相對熱阻和抵抗力如表5-1.微生物熱死亡的數(shù)學規(guī)律微生物的熱死亡規(guī)律符合對數(shù)規(guī)律。微生物的死亡速率 (dN/dt) 與任何一瞬時殘存的活菌數(shù)成正比，稱之為對數(shù)殘留定律，用下式表示： 第十三頁，共六十九頁。式中：N為培養(yǎng)基中殘存的活菌數(shù)(個)；t為滅菌時間(s)； k為滅菌反應速度常數(shù)或稱為菌比死亡速率(s-1),值的大小與滅菌溫度和菌種特性有關； dN/dt為活菌數(shù)的瞬時變化速率，即死亡速率(個/s)。(5-1)第十四頁，共六十九頁。一、濕熱滅菌的基本原理滅菌時間的確定將式5-1積

6、分，有：式中：N0為滅菌開始時原有的菌數(shù)(個)；Nt為滅菌結束時殘留的菌數(shù)(個)。(5-2)第十五頁，共六十九頁。一、濕熱滅菌的基本原理影響滅菌時間的因素污染程度 (N0) 滅菌程度或要求 (殘留的活菌數(shù)Nt)滅菌反應速度常數(shù) k實際滅菌要求Nt常要求1/1000。熱死速率常數(shù) k的判定可以把微生物熱死過程看成一簡單一級化學反應,熱死速度即反應速度，活菌數(shù)即反應物，而熱死速率常數(shù)即反應速率常數(shù)，則由Arrhenius定律有：第十六頁，共六十九頁。式中：A為比例常數(shù)，s-1；E為活化能，J/mol；R為氣體常數(shù)，8.314 J/(molK)；T為絕對溫度，K。 k 值與活化能的關系 活化能處于指

7、數(shù)項，可見其與 k 值的變化關系密切。 高溫瞬時滅菌 (HTST) 營養(yǎng)損失小的原理，可以從細菌與一些營養(yǎng)物的不同活化能得到解釋。(5-3)第十七頁，共六十九頁。一、濕熱滅菌的基本原理k 值與溫度的關系 式5-3可以變化為： 圖5-2顯示了這種關系。k 隨溫度的升高而升高，同一溫度下，隨微生物種類 (活化能)不同而不同。參見表5-5.殺滅細菌芽孢時間的估算與芽孢的種類和培養(yǎng)條件有關。(5-4)第十八頁，共六十九頁。一、濕熱滅菌的基本原理可以根據(jù)Q10估算。表5-6a 估算的芽孢不同溫度大概滅菌時間表5-6b 一些細菌芽孢的實際殺滅時間第十九頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌（一）培養(yǎng)基的滅菌方法

8、分批滅菌概念： 又稱為間歇滅菌，就是將配制好的培養(yǎng)基全部輸入到發(fā)酵罐內(nèi)或其它裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設備加熱 至滅菌溫度后維持一定時間，再冷卻到接種溫度。也稱為實罐滅菌或實消。 第二十頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌過程：包括升溫、保溫和冷卻等3個階段。圖5-4 培養(yǎng)基分批滅菌過程中溫度變化情況 第二十一頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌操作步驟空氣過濾器滅菌干燥打料，開攪拌開排氣閥，開夾套 (蛇管) 預熱至8090同時從卸料管道進氣至121三路進汽，四路出汽保溫30min先后關閉排汽和進汽閥門，同時逐漸通入無菌空氣夾套 (蛇管) 冷卻至接種溫度第二十二頁，共六十九頁。圖5-5 分批滅菌的

9、進汽、排汽及冷卻水管路系統(tǒng) 1. 空氣過濾器滅菌干燥2. 打料，開攪拌3. 開排氣閥，開夾套 (蛇管) 預熱至80904.同時從卸料管道進氣至1215. 三路進汽，四路出汽保溫30min6. 先后關閉排汽和進汽閥門，同時逐漸通入無菌空氣7. 夾套 (蛇管) 冷卻至接種溫度第二十三頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌分批滅菌的優(yōu)點：設備、操作簡單，適合小規(guī)模發(fā)酵分批滅菌的缺點：周期長、能耗大，營養(yǎng)成分破壞大連續(xù)滅菌概念：連續(xù)滅菌是將培養(yǎng)基通過專門設計的滅菌器，進行連續(xù)流動滅菌后，進入預先滅過菌的發(fā)酵罐中的滅菌方式，也稱之為連消。特點：快速，營養(yǎng)成分破壞少滅菌流程見圖5-5.第二十四頁，共六十九頁。圖

10、5-6 培養(yǎng)基連續(xù)滅菌的基本流程 關鍵點：培養(yǎng)基物料少而分散第二十五頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌固體培養(yǎng)基的滅菌特點：固體培養(yǎng)基一般為粒狀、片狀或粉狀，流動性差，也不易翻動，加熱吸水后成團狀，熱傳遞性能差，降溫慢。滅菌方法：自制土蒸鍋轉鼓式滅菌器（見下頁圖）第二十六頁，共六十九頁。圖5-7 某食用菌工廠的轉鼓式滅菌器 第二十七頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌（二）影響培養(yǎng)基滅菌的因素培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基中的油脂、糖類和蛋白質會增加微生物的耐熱性。培養(yǎng)基中高濃度的鹽類等會減弱微生物細胞的耐熱性。例如：對大腸桿菌，熱死環(huán)境水中10%糖液30%糖液熱死條件65 1min 70 5min 70 30m

11、in第二十八頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基成分的顆粒度一般對小于1mm顆粒的培養(yǎng)基，可不必考慮顆粒對滅菌的影響，但對含有大顆粒和粗纖維的基質要考慮其結團的影響。培養(yǎng)基的pH值pH值6.0，氫離子易滲入微生物細胞內(nèi)，從而改變細胞的生理反應促使其死亡。微生物細胞含水量水分含量低蛋白不易變性，滅菌效果差。第二十九頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌微生物性質與數(shù)量不同微生物種類耐熱性有很大差距生理時期上對數(shù)期耐熱性較差微生物數(shù)量越多耐熱性越強耐熱個體出現(xiàn)機會多傳熱和死角培養(yǎng)基中的天然成分含菌較多冷空氣排除情況原理：冷空氣阻礙蒸汽傳熱且減小分壓第三十頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌滅菌對象體積不論

12、在實驗室還是在生產(chǎn)車間，滅菌體積越大，滅菌時間越長。其他如上磅下磅速度，發(fā)酵罐內(nèi)部構造(實消)，攪拌的力度等都會對培養(yǎng)基滅菌效果產(chǎn)生一定的影響。第三十一頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌（三）培養(yǎng)基滅菌時間的計算分批滅菌簡化：不計升溫與降溫階段所殺滅的菌數(shù)，實際時間較計算值略短?？梢杂墒?5-2)求得。例5-1 某發(fā)酵罐內(nèi)裝培養(yǎng)基40m3，在121下進行分批滅菌。設每毫升培養(yǎng)基中含耐熱芽孢桿菌為2105個，121時的滅菌速度常數(shù) (5-2)第三十二頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌 為1.8 min-1。求理論滅菌時間（即滅菌失敗機率為0.001時所需要的滅菌時間）。解：N0=401062105=

13、81012個 Nt=0.001個 k= 1.8 min-1滅菌時間： 若考慮升溫階段(一般100以上)的殺菌貢獻，則關鍵是估算出在這一階段的平均熱死速率常數(shù)km，就可根據(jù)這段時間tp計算出實際初始菌 第三十三頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌 量Np，進而求出實際所需保溫時間t。在這里由于現(xiàn)在普遍采用迅速降溫的措施，時間短，所以在計算時一般不考慮降溫的殺菌貢獻。 若以芽孢為標準，則在計算熱死速率常數(shù)k的式(5-4)中一般系數(shù)A可取1.341036s-1，E可以取2.844105 J/mol，則該式化為式 (5-5)。(5-4)(5-5)第三十四頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌利用式 (5-5)可

14、求得不同滅菌溫度下的速度常數(shù)，再以圖解積分法求出溫度效應總和，即可求出km：則升溫階段結束時，培養(yǎng)基中殘留菌數(shù)Np可從下式求得： (5-6)(5-7)第三十五頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌則保溫所需時間為：利用式 (5-8)就可以計算考慮升溫階段的情況下的實際保溫時間。例5-2 在例5-1中，滅菌過程的升溫階段，培養(yǎng)基從100上升至121，共需15min，若升溫階段按3的梯度近似計算，求升溫階段結束時,培養(yǎng)基中的芽孢數(shù)和保溫所需的時間。(5-8)第三十六頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌解：T1=373K T2=394K 由式 (5-5)可以分別求得各個溫度梯度下的熱死速率常數(shù)： 再由圖解積分

15、法 (梯形法)求得升溫階段總效應： =(k1T+k2T+k7T)+ (k2T+k3T +k8T)/2 0.127 K/sT/K373376379382385388391394/s-12.0910-44.3510-48.9410-41.8110-33.6410-37.2410-31.4210-22.7710-2kT6.2710-413.0510-426.8210-45.4310-310.9210-321.7210-34.2610-28.3110-2第三十七頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌則升溫階段平均熱死速率常數(shù)km為：則升溫階段結束芽孢數(shù)Np為：則保溫時間t為：(s-1)(個)第三十八頁，共六

16、十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌由此可見，考慮升溫階段的滅菌作用后，保溫時間比不考慮的減少了14.9%。所以發(fā)酵罐體積越大，其分批滅菌的升溫時間越長，升溫階段的對滅菌的貢獻就越大，相應的保溫時間就越短。 (min)第三十九頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌的理論滅菌時間的計算仍可采用對數(shù)殘留定律，如果忽略升溫的滅菌作用，則滅菌保溫的時間：式中：C0 為單位體積培養(yǎng)基滅菌前的含菌數(shù)，個/mL；Ct 為單位體積培養(yǎng)基滅菌后的含菌數(shù)，個/mL。 (5-9)第四十頁，共六十九頁。二、培養(yǎng)基的滅菌例5-3 若將例5-1中的培養(yǎng)基采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度為131，此溫度下滅菌速度常數(shù)為15min-1，

17、求滅菌所需的維持時間。解：C0= 2105 個/mL Ct= 1 /40106103= 2.510-11 個/mL 所以維持時間t為：可見時間大大縮短(由于反混，實際時間略長)。 (min)第四十一頁，共六十九頁。三、發(fā)酵設備的滅菌進行氣密性檢查后，發(fā)酵前需要對發(fā)酵罐及其附屬設備、管線進行滅菌，即“空消”。發(fā)酵罐：0.1 MPa 30 min空氣過濾器：0.15 MPa 2 h補料罐：根據(jù)培養(yǎng)基情況接種管線：0.4 MPa 1 h消泡劑、酸、堿、電極、取樣等其他管線：0.1 MPa 30 min本節(jié)結束謝謝第四十二頁，共六十九頁。滅菌Sterilization徹底殺滅或去除消毒Disinfec

18、tion殺死病原菌防腐Antisepsis食品化療Chemotherapy宿主體內(nèi)殺死 / 抑制病原菌 / 所有微生物具體因素抑制殺滅或抑制與滅菌相關的幾個概念第四十三頁，共六十九頁。圖5-1 制菌、殺菌和溶菌的比較第四十四頁，共六十九頁。表5-2 常見化學殺菌劑及其作用機制和應用范圍 2,7-二溴-4-羥汞基熒光紅雙鈉鹽十二烷基二甲基芐基溴化銨（苯扎溴銨）十二烷基-二甲基-2-苯氧基-乙基溴化銨龍膽紫第四十五頁，共六十九頁。放射性射線射線：由放射性同位素如60Co或137Cs產(chǎn)生。是一種高能電磁波，波長很短(0.001-0.0001nm)，穿透力強，射程遠，危險性大，必須屏蔽(幾個cm的鉛板

19、或幾米厚的混凝土墻)。X射線：由x光機產(chǎn)生的高能電磁波。波長比射線長，一般小于10埃，射程略近，穿透力不及射線。有危險，應屏蔽(幾毫米鉛板)。射線：由放射性同位素(如32P、35S等)衰變時放出來帶負電荷的粒子。在空氣中射程短，穿透力弱。在生物體內(nèi)的電離作用較射線、x射線強。第四十六頁，共六十九頁。放射性射線中子流：不帶電的粒子流。輻射源為核反應堆、加速器或中子發(fā)生器，在原子核受到外來 粒子的轟擊時產(chǎn)生核反應，從原子核里釋放出來，電離密度大，常常引起大的突變，可以用于輻射育種。射線：穿透力弱而電離能力強，本質是氦的原子核，鐳、鈾等產(chǎn)生，在人體外部不構成危險。此外還有紫外線、激光等，其中射線和紫

20、外線常用來進行表面滅菌。第四十七頁，共六十九頁。濕熱法干熱法高壓蒸汽滅菌蒸煮法連續(xù)式間歇式巴式法烘箱火焰熱滅菌熱滅菌方法的分類第四十八頁，共六十九頁。第四十九頁，共六十九頁。第五十頁，共六十九頁。第五十一頁，共六十九頁。第五十二頁，共六十九頁。嗜冷菌耐冷菌嗜溫菌嗜熱菌極端嗜熱菌溫度與微生物生長的關系第五十三頁，共六十九頁。微生物營養(yǎng)細胞芽孢 / 孢子/ 芽體YeastMoldBacteriaVirus5 min at 50 60 C30 min at 62 C10 min at 60 70 C30 min at 60 C5 min at 70 80 C30 min at 80 C2 to ov

21、er 800 min at 100 C0.5 30 min at 121 C微生物細胞的熱死速度第五十四頁，共六十九頁。熱滅菌效率的衡量TDP - thermal death point 在10 min內(nèi)殺死某微生物試樣的最低溫度。TDT - thermal death time在某特定溫度和其它條件下，殺死一個試樣中所有微生物的最短時間。the D value - decimal reduction time在某特定溫度和其它條件下，殺死一個試樣中所有微生物的90的最短時間。the z value - 使D值下降到1 / 10所需要升高的溫度。the F value -在某特定溫度(121

22、C)和其它條件下，殺死微生物到特定數(shù)量級的時間。第五十五頁，共六十九頁。第五十六頁，共六十九頁。第五十七頁，共六十九頁。例如：罐裝食品的滅菌以殺滅肉毒梭菌(Clostridium botulinum)的芽孢為標準，以防止肉毒梭菌中毒(Botulism)。某批滅菌殺滅芽孢從1012到100（一個）。D121 = 0.204 min 在121 C 完成滅菌共需 D， min。如果肉毒梭菌芽孢的 z 值是10 C，則在111 C 滅菌時需 D， min。122.51224.5第五十八頁，共六十九頁。表5-1某些微生物的相對熱阻和對滅菌劑的相對抵抗力(與大腸桿菌比較) 第五十九頁，共六十九頁。1069105104910491039109102910510311010290%90%熱第六十頁，共六十九頁。表5-3 某