酒精性肝纖維化中Smad4的表達(dá)情況研究

1、酒精性肝纖維化中Smad4的表達(dá)情況研究作者:吳凌康王小奇任自立葉尉摘要：目的為了討論Sad4在酒精性肝病肝組織中的表達(dá)和分布情況，提醒酒精性肝病的局部發(fā)病機(jī)制。方法采用肝纖維化assn染色考察酒精肝纖維化程度，用免疫組化考察Sad4分子在酒精性肝病肝組織中的表達(dá)，用RT-PR方法考察Sad4在核酸程度的表達(dá)和分布情況。結(jié)果正常肝組織和酒精肝早期，Sad4表達(dá)為陰性，酒精肝纖維化階段Sad4表達(dá)顯著陽性，主要分布在匯管區(qū)，壁周隙，纖維間隔等非本質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)一步以PR方法考察，發(fā)現(xiàn)正常組和酒精肝晚期組相比擬，其Sad4的表達(dá)量有顯著差異。結(jié)論Sad4參與了酒精性肝纖維化。關(guān)鍵詞酒精性肝??；肝纖維化

2、；Sad4；TGF-betaAbstratbjetiveTinvestigatetheexpressinandrlefSad4inALD.ethdsiunhistheistryandreversetransriptinplyerasehainreatinasused.ResultsThereisnexpressinfSad4innralliverandliverfearlierperidALD.Sad4signifiantlyinreaseinliverflateperidALD.Theyainlydistributedinprtalarea,perisinusidalspaeandfibru

3、ssepta.nlusin:Sad4ightbeaiprtantfatrffibrgenesisinlateperidfAlhliLiverDisease.KeyrdsAlhliLiverDiseasSad4liverfabrsisTGF-beta近年來隨著酒精消耗量的增加，酒精性肝病的發(fā)病率呈上升的趨勢，酒精性肝病包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化肝硬化，該病的發(fā)病機(jī)制尚不明了，但肝纖維化無疑是該病后期的一個(gè)重要的病理改變。已有研究說明TGF-beta是肝纖維化的一個(gè)極重要的啟動因子，而在TGF-beta下游存在一個(gè)復(fù)雜的Sads信息傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，Sad4是其中一個(gè)重要的信號分子，為了

4、探察，Sad4是否參與酒精性肝病的發(fā)生開展，本實(shí)驗(yàn)以酒精灌胃制作大鼠酒精肝模型，以免疫組織化學(xué)和RT-PR的方法考察了酒精肝組織中Sad4的表達(dá)和分布情況。材料與方法1、實(shí)驗(yàn)動物采用安康，性成熟，一級質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的S-D大鼠34只，雌雄各半，體重180-210g，分籠喂養(yǎng)。大鼠由浙大醫(yī)學(xué)院動物中心提供。2、主要試劑:蘇木素染料，麗春紅染料，亮綠染料，兔抗大鼠Sad4多抗一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔多抗二抗，Trizl試劑，-LV逆轉(zhuǎn)錄酶，Tag酶，10/LdNTPPR儀等。3、酒精肝模型以上實(shí)驗(yàn)動物在浙大醫(yī)學(xué)院動物中心以清潔二級喂養(yǎng)，隨機(jī)分為兩組，均為雌雄各半，白酒灌胃24只，三個(gè)月后處死10只獲

5、得肝臟標(biāo)本，局部浸泡于10%福爾馬林中留于病理檢查，局部置于液氮中再保存于-80度冰箱中用于RT-PR。六個(gè)月后再處死另一批11只老鼠處理同前。實(shí)驗(yàn)過程中死亡3只，原因不明。另10只免白酒灌胃，以等量生理鹽水灌胃，6個(gè)月后全部處死，標(biāo)本處理如上。因此大鼠肝臟標(biāo)本分為：A組10只正常對照組織；B組10只酒精灌胃3個(gè)月組；組10只酒精灌胃六個(gè)月組。4肝組織assn染色觀察切片脫蠟脫水后蘇木酸染色8分鐘酒精分化水洗，1%麗春紅酸性品紅染色8分鐘，水洗后1%磷鉬酸染色6分鐘，0.2%亮綠5分鐘，水洗，封片。5、免疫組織化學(xué)檢測用invisin法，探測各組模型肝組織中Sad4的分布和表達(dá)強(qiáng)度，陽性對照由

6、武漢博士德公司提供，另以動物羊血清代替一抗制作陰性對照，結(jié)果斷定：鏡下組織切片出現(xiàn)棕黃色染色那么判為為陽性片。6、RT-PR檢測1引物設(shè)計(jì)：從基因BANK檢索Sad4基因的全序列基因號AB010954，設(shè)計(jì)正鏈引物序列為5ATTGGAATTATGGGGTTA3反義鏈引物序列為5TGGTGGGAGAGTGGGT3。擴(kuò)增片段為大小為500BP2內(nèi)對照基因使用GAPDH，設(shè)計(jì)正義鏈為5-TGAAGAAGAAGGGGA-3反義鏈為5GGTAAGAGTTGGTGGTG-3擴(kuò)增片段為大小為349BP3標(biāo)本總RNA提?。簭?80度冰箱里取黃豆大小酒精肝組織，加液氮用研缽研磨，加1lTrizl試劑，再加氯仿提

7、取總RNA，無水乙醇沉淀，溶解于DEP水處理過的蒸餾水中，提取的RNA經(jīng)過分光光度計(jì)測定D值，要求D260/D2802.(4)逆轉(zhuǎn)錄參照上海生工LV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，合成DNA，取總RNA稀釋至濃度為50ug/ul取10ul總RNA參加1ulligdT放入70攝氏度5分鐘后冰置，參加4ul5*緩沖液2ul4dNTPix2ul用雙蒸水加至19ul，37攝氏度5分鐘后再參加200uLV1ul42攝氏度孵育60分鐘后轉(zhuǎn)入70度水浴，獲得DNA低溫冰箱保存5PR反響模板DNA2ul各引物1ulTag酶0.2ul參加4ulPRIX含104dNTP0.8ul，25l/LgL21.2ul，10*buffl

8、e2ul加水至20ul反響體系。按以下程序進(jìn)展基因擴(kuò)增，955-(951-611-722)35循環(huán)-7210(5)取10ulPR反響產(chǎn)物與2ul溴酚蘭混合加樣于電泳槽以5v/進(jìn)展電泳，行熒光掃描。5各個(gè)標(biāo)本DNA循以上方法進(jìn)展擴(kuò)增內(nèi)對照GAPDH，并電泳，行熒光掃描。6經(jīng)熒光掃描獲得兩組各個(gè)標(biāo)本的Sad4/GAPDH值。7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS11.5進(jìn)展分析，組間均數(shù)比擬采用Independent-SapleTTest，并進(jìn)展Spearan相關(guān)性分析。結(jié)果1、肝組織纖維化染色assn染色發(fā)現(xiàn)組標(biāo)本的匯管區(qū)，纖維間隔，血管壁均被染為墨綠色。A組織和B組只有少量血管壁被染為墨綠色。說明組酒精肝模

9、型歸屬典型的酒精性肝纖維化期。A組和B組無纖維化表現(xiàn)。2、酒精肝肝組織中Sad4蛋白的表達(dá)定性免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)組所有切片組織切片中多區(qū)域明顯染為棕黃色，說明這些區(qū)域中Sad4表達(dá)強(qiáng)度較高。這些區(qū)域主要是匯管區(qū)非本質(zhì)細(xì)胞，肝小葉周圍，竇壁周圍，纖維間隔。A組和B組根本上無棕黃色染色，說明A組和B組標(biāo)本根本上無Sad4表達(dá)。3、酒精肝組織中Sad4RNA的表達(dá)半定量結(jié)果如下表：熒光強(qiáng)度比Sad4/GAPDH編號A組組10.122.3720.292.0230.2110.5340.111.3850.382.8860.0021.570.252.980.201.3490.181.25100.223.0

10、8均值X+S0.20+0.1042.93+2.76兩組均值經(jīng)t檢驗(yàn)有顯著差異P0.01。4、Spearan相關(guān)性分析說明，Sad4表達(dá)程度與肝纖維化呈正相關(guān)P0.01。討論酒精肝按病理過程可以分為，酒精性脂肪肝，酒精性肝炎，酒精性肝纖維化，酒精性肝硬化四個(gè)類型。其中酒精肝晚期的酒精性肝纖維化、肝硬化的根本病理改變是出現(xiàn)膠原纖維大量增生。近年研究發(fā)現(xiàn)，TGF-beta下游存在一個(gè)復(fù)雜的Sad網(wǎng)絡(luò)，TGF-beta的信號通過Sad家族實(shí)現(xiàn)對基因的調(diào)控。GF-beta直接結(jié)合TBRII或通過B-多聚糖間接結(jié)合TBRII，形成TGF-beta/TBRII復(fù)合物并迅速導(dǎo)致TBRI的磷酸化，磷酸化的TBR

11、I可以活化受體特異性sadsad2或sad3使其磷酸化，并與通用型sadsad4結(jié)合形成異源復(fù)合物，轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。不同類型的細(xì)胞TGF-beta誘導(dǎo)產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)不同，可刺激或抑制細(xì)胞生長，產(chǎn)生一個(gè)廣泛的生物學(xué)效應(yīng)1已有大量實(shí)驗(yàn)說明，TGF-beta參與了肝纖維化過程中膠原的增生23，sad蛋白是TGF-beta受體復(fù)合物體下游一類非常重要的信號分子，同時(shí)具有轉(zhuǎn)錄活化功能，可將TGF-beta超家族的信號直接從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與纖維化基因表達(dá)相偶連4，Sad4作為TGF-beta下游的一個(gè)重要信號傳導(dǎo)分子，它在酒精性肝纖維化中，起著何中作用？為此我們用免疫組織化學(xué)的方法考察

12、了，Sad4在酒精肝各階段組織中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)如今酒精肝早期和正常肝組織中，纖維化染色是不明顯的，Sad4表達(dá)也是陰性的，隨著酒精肝纖維化程度的進(jìn)步，在組肝臟標(biāo)本中，纖維化染色陽性，Sad4染色也出現(xiàn)了陽性，相關(guān)性分析說明，Sad4表達(dá)與肝纖維化呈正相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)提示Sad4參與了酒精肝晚期的膠原纖維增生。參考文獻(xiàn)1.iyaznK.TGF-beta/SADsignalinganditsinvlveentinturprgressinJ.BilpharBull,2000,23(10):1125-11302.Rult,SevsikA,steT,etal.Rleftransfringgrthfatrbetatype2reeptrinhepatifibrsis:studiesfhuahrnihepatitisandexperientalfibrsisinratsJ.Heptalgy,1999,29(6):1730