端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在急性壞死性胰腺炎大鼠中性粒細(xì)胞凋亡中的作用

1、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在急性壞死性胰腺炎大鼠中性粒細(xì)胞凋亡中的作用SAP是由胰腺局部炎癥所致，累及全身炎癥反應(yīng)綜合征，繼而造成多器官功能障礙綜合征的臨床危重病。“白細(xì)胞過度激活學(xué)說”是SAP發(fā)病的重要機(jī)制之一。胰腺組織自身消化釋放內(nèi)源性物質(zhì)，激活中性粒細(xì)胞，使得其凋亡延遲，繼而釋放大量炎癥因子，引發(fā)“瀑布”效應(yīng)，致使SAP患者出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)僅在腫瘤細(xì)胞、生殖細(xì)胞、造血細(xì)胞中表達(dá)。2008年Lepreux等首次發(fā)現(xiàn)TERT在中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)。近年有研究報(bào)道，冠心病、原發(fā)性卵巢功能不全患

2、者中性粒細(xì)胞TERT水平異常表達(dá)，中性粒細(xì)胞凋亡延遲，但迄今為止，未見SAP時(shí)中性粒細(xì)胞TERT表達(dá)水平的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究探討TERE對(duì)急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)大鼠中性粒細(xì)胞凋亡的影響。材料與方法一、動(dòng)物與分組24只SPF級(jí)Sprague-Dawley雄性大鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0005。大鼠禁食12 h，自由飲水，按數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組，ANP 3、6 h組和TERT抑制劑BIBR1532干預(yù)組（BIBR1532組），每組6只。ANP組大鼠采用胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c

3、(1 ml/kg)造模，分別在造模后3、6 h處死，經(jīng)心臟采血。BIBR1532組大鼠在造模前腹腔注射2 mg/kg TERT抑制劑BIBR1532（美國EMC公司），每周3次，連續(xù)2周，于造模3 h后處死，經(jīng)心臟采血。正常對(duì)照組大鼠未經(jīng)任何處理。取各組大鼠胰腺組織，置10%甲醛溶液中固定。二、方法1外周血中性粒細(xì)胞分離：采集的大鼠血樣本經(jīng)1%葡聚糖沉淀紅細(xì)胞，取上層富含粒細(xì)胞的血漿，按11容積加入大鼠淋巴細(xì)胞分離液，以1 500r/min離心20 min，離心半徑9 cm。通過低滲溶液溶解紅細(xì)胞，Percoll密度梯度離心法分離中性粒細(xì)胞，采用臺(tái)盼藍(lán)、瑞氏染色檢測(cè)中性粒細(xì)胞存活率和純度。2中

4、性粒細(xì)胞TERT mRNA檢測(cè)：應(yīng)用熒光定量PCR法檢測(cè)中性粒細(xì)胞的TERT mRNA表達(dá)量。TERT正向引物序列為5-CAGATGCGACCCCTATTC-3，反向引物序列為5-TGTAACCGGAGCAAACTC-3；內(nèi)參GAPDH正向引物序列為5-TATCGGACGCCTGGTTAC-3，反向引物序列為5-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。反應(yīng)條件：95 10 min，95 15 s、60 15 s，40個(gè)循環(huán)。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，以公式2Ct計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。3中性粒細(xì)胞TERT蛋白及凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)：采用蛋白質(zhì)免疫印跡

5、法檢測(cè)TERT蛋白及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xL、Bax表達(dá)量?？筎ERT、Bcl-xL、Bax單克隆抗體購自英國abcam公司，工作濃度均為11 000；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，工作濃度為1200。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。Image J軟件分析各條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比為蛋白相對(duì)表達(dá)量。4中性粒細(xì)胞凋亡檢測(cè)：取含2106/ml中性粒細(xì)胞的RPMI1640培養(yǎng)液500l，均勻接種于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)16 h后，依次加入2.5 l Annexin V-FITC 和5.0l碘化丙啶（PI）溶液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞凋亡。5血清TNF

6、-、IL-6檢測(cè)：收集與分離大鼠外周血血清，ELISA檢測(cè)試劑盒 （美國eBioScience 公司）檢測(cè)各組大鼠血清TNF-、IL-6水平，按試劑盒說明書操作。6胰腺組織病理學(xué)檢查：取甲醛溶液固定的胰腺組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理改變。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用xs表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P95%（圖1A）；臺(tái)盼藍(lán)染色顯示極少量細(xì)胞呈淡藍(lán)色，中性粒細(xì)胞存活率97%（圖1B）。正常對(duì)照組、ANP 3 h組、ANP 6 h組、BIBR1532組外周血中性粒細(xì)胞TERT mRNA表達(dá)量分別

7、為1.030.26、3.311.07、5.210.78、1.950.49，TERT蛋白表達(dá)量分別0.090.03、0.430.12、0.580.11、0.220.07（圖2），ANP 3、6 h 組TERT mRNA及蛋白表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，而BIBR1532組低于ANP 3 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為5.08、12.52、2.82，6.92、7.69、4.05；P值均0.05）。表明TERT mRNA及蛋白在ANP大鼠外周血中性粒細(xì)胞中高表達(dá)。二、各組大鼠中性粒細(xì)胞Bcl-xL、Bax蛋白的表達(dá)正常對(duì)照組、ANP 3 h組、ANP 6 h組、BIBR1532組中性粒細(xì)胞的Bcl

8、-xL蛋白表達(dá)量分別為0.190.05、0.500.07、0.850.04、0.400.11，Bax蛋白表達(dá)量分別0.290.08、0.230.03、0.170.02、0.430.12(圖3)。與正常對(duì)照組比較，ANP 3、6 h組的Bcl-xL表達(dá)量上升（t值分別為7.75、16.30，P值均0.05），而Bax表達(dá)量下降（t值分別為4.22、6.74，P值均0.05）；與ANP 3 h組比較，BIBR1532組Bcl-xL表達(dá)量下降（t=5.42，P0.05），而Bax表達(dá)量上升（t=5.59，P0.05）。表明TERT表達(dá)量升高則抑制ANP大鼠外周血中性粒細(xì)胞凋亡。三、各組大鼠中性粒細(xì)胞

9、凋亡率中性粒細(xì)胞體外培養(yǎng)16 h后，正常對(duì)照組、ANP 3 h組、ANP 6 h組、BIBR1532組外周血中性粒細(xì)胞凋亡率分別為（10.030.74）%、（7.990.27）%、（6.650.36）%、（22.982.86）%。ANP 3、6 h 組中性粒細(xì)胞凋亡率低于正常對(duì)照組，而BIBR1532組高于ANP 3 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為4.52、7.27、12.63，P值均0.05，圖4）。四、各組大鼠血清TNF-、IL-6水平正常對(duì)照組、ANP 3 h組、BIBR1532組血清TNF-水平分別為(96.6727.12)、(382.3046.33)、(206.8836.42)

10、 ng/L，IL-6水平分別為(43.3414.50)、(134.2116.13)、(88.0613.05)ng/L，ANP 3 h組TNF-、IL-6水平均高于正常對(duì)照組，BIBR1532組TNF-、IL-6水平均低于ANP 3 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為22.57、12.63,17.77、9.43；P值均0.05）。表明TERT高表達(dá)可上調(diào)血清TNF-、IL-6水平。五、各組大鼠胰腺組織的病理改變正常對(duì)照組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，無間質(zhì)充血、出血和腺泡細(xì)胞壞死。ANP組大鼠胰腺組織可見大量的炎癥細(xì)胞浸潤，小葉間隔增寬、結(jié)構(gòu)破壞，組織壞死。BIBR1532組大鼠胰腺組織病理改變較AN

11、P組明顯改善（圖5）。表明TERT高表達(dá)可加重ANP大鼠胰腺組織的炎癥損傷。討 論端粒酶為自身攜帶模板的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，由TERT、端粒酶RNA、端粒酶相關(guān)蛋白3個(gè)主要的亞單位組成。端粒酶是細(xì)胞凋亡延遲的關(guān)鍵信號(hào)分子，通過端粒和非端粒保護(hù)機(jī)制，維持端粒長度和改善線粒體功能，抑制細(xì)胞凋亡。TERT是端粒酶活化的限速酶，其表達(dá)程度反映端粒酶活性水平。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化大鼠在持續(xù)炎癥遞質(zhì)刺激下，其動(dòng)脈組織的端粒酶活性增加13倍；不穩(wěn)定型心絞痛患者外周血中性粒細(xì)胞端粒酶活性較健康者增加2倍，從動(dòng)脈粥樣硬化患者的硬化斑塊分離出的中性粒細(xì)胞中端粒酶活性增加更顯著，其中35%患者的端粒酶活性增加50倍；原發(fā)性卵巢功能不全患者外周血中性粒細(xì)胞的端粒酶活性下降3倍，加速細(xì)胞衰老過程，進(jìn)而導(dǎo)致卵巢內(nèi)卵泡的耗竭或功能失常。2011年von Figura等報(bào)道端粒酶基因敲除小鼠胰腺外分泌腺的再生能力降低，顯示端粒酶參與急性胰腺炎的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，ANP 大鼠外周血中性粒細(xì)胞的TERT mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡的時(shí)間