基因工程原理及技術(shù)

1、基因工程原理及技術(shù)Field after one round of application of Roundup herbicideTransgenic tomato plants show resistance (left) while non-transformed plants are susceptible to cucumber mosaic virus under field conditions (right)/online/feature/BioTechnology/Images/2.4.jpgInsect infestation on Bt (right) and non-B

2、t (left) cotton bolls/programs/lifesciences/TransgenicCrops/images/cotton.jpgWild-type corn showing infestation - Bt corn is resistant to thisPotatoes are one of many plants being used to produce vaccines/sept_issue/images/breakthrough/veggievaccine.jpgGolden rice and normal (white)/ wsjbiotech.html

3、嗯？！真的？預(yù)防傳染??！還不快吃愣什么！DNA IS EVERYWHERE 植物？動物？物種？第一章 基因工程概述1 .什么是基因？ 基因是遺傳信息的基本單位。基因是一段核苷酸序列；可以是連續(xù)的，也可以是不連續(xù)的；可以是DNA也可以是RNA；可以存在于染色體上，也可以存在于染色體之外（如質(zhì)粒等）?；蚓哂锌煞中?、重疊性和可變性。一、基因的結(jié)構(gòu)-基因操作的理論基礎(chǔ)下面收錄了對基因的五個定義 1,基因是存在于細(xì)胞內(nèi)有自我繁殖能力的遺傳單位. 2,基因是一個具有遺傳功能的特定核苷酸序列的DNA片段. 3,編碼一個RNA或一條多肽鏈的DNA片段稱為一個基因. 4,基因是生物體遺傳的基本單位,存在于細(xì)胞

4、的染色體上,作直線排列. 5,基因是生物體內(nèi)一切具有自主復(fù)制能力的最小遺傳功能單位,其物質(zhì)基礎(chǔ)是一條以直線排列具有特定核苷酸序列的核酸片段.基因轉(zhuǎn)錄原核蛋白質(zhì)編碼基因的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄起始位點核糖體結(jié)合位點5UTR3UTRATGTAA轉(zhuǎn)錄區(qū)啟動子終止子真核蛋白編碼基因的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄終止位點基因的結(jié)構(gòu)2. 基因及其產(chǎn)物的共線性 基因決定蛋白質(zhì)的序列組成，是由密碼子對應(yīng)特定氨基酸所決定的。當(dāng)一個基因的核苷酸序列與其產(chǎn)物的氨基酸序列是一一對應(yīng)時，則表明它們是共線性的。3. 基因及其產(chǎn)物的非共線性 由于真核生物的斷裂基因具有內(nèi)含子，使得一個基因的核苷酸序列與其產(chǎn)物的氨基酸序列不是一一對應(yīng)關(guān)系，則表明基因及其產(chǎn)物是

5、非共線性的。 ATG GCG GCT GCC GGT GCT CTC TTT TTC CTA TTC TCC TCC TTC TGC Met Ala Ala Ala Gly Ala Leu Phe Phe Leu Phe Ser Ser Phe CysATG GCG GCT GCC GGT GCT CTC TTT TTC CTA TTC TCC TCC TTC TGC Met Ala Ala Ala Gly Ala.Phe Ser Ser Phe Cys內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn)1977年美國的Sharp和Roberts兩組科學(xué)家別同時發(fā)現(xiàn)了斷裂基因(split gene)1978年Gilbort創(chuàng)用了內(nèi)含

6、(intron)和外顯子 (exon) 兩個名詞，內(nèi)含子是指在成熟的mRNA中不出現(xiàn)的序列，Exon是指在成熟的mRNA中出現(xiàn)的編碼序列。腺病毒外殼蛋白基因的結(jié)構(gòu)斷裂基因:有些真核蛋白質(zhì)編碼基因的核苷酸序列中間插有與氨基酸編碼無關(guān)的DNA間隔區(qū)，使一個基因分隔成不連續(xù)的若干區(qū)段，我們稱這種編碼序列不連續(xù)的基因為斷裂基因。內(nèi)含子（intron)： 指真核生物基因中不能翻譯成蛋白質(zhì)的DNA片段，但可被轉(zhuǎn)錄。當(dāng)外顯子轉(zhuǎn)錄的RNA被剪接在一起時，就將內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的RNA從整個轉(zhuǎn)錄物中除去。內(nèi)含子不是一成不變的，具有相對性。外顯子（extron)： 外顯子是指能夠翻譯成蛋白質(zhì)的任一間斷的基因片段，一個基因

7、可有多個外顯子。內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn)1977年美國的Sharp和Roberts兩組科學(xué)家分別同時發(fā)現(xiàn)了斷裂基因(split gene)，Crick稱此為分子遺傳學(xué)上的一次微型革命，這項發(fā)現(xiàn)與1993年榮獲了諾貝爾獎。就在Sharp和Roberts發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子之前，法國的科學(xué)家Chambon也率領(lǐng)一個小組進(jìn)行了有關(guān)實驗。他們在思考一個問題，雞的輸卵管分泌卵清蛋白、卵粘蛋白和伴清蛋白，而其紅細(xì)胞（鳥類的紅細(xì)胞上有核的）只合成血紅蛋白，那么兩種組織之間DNA有什么不同呢？于是他們提取兩種組織的DNA，分別用酶（EcoR1和HindIII）切成幾段，走電泳，再用卵清蛋白mRNA來制備cDNA探針和以上兩片進(jìn)行s

8、outhern雜交，結(jié)果兩種組織中的DNA不論用哪一種酶來切，都出現(xiàn)了相同的多條陽性雜交帶。實驗表明不論是紅細(xì)胞還是輸卵管的細(xì)胞，雖基因表達(dá)不同，但DNA的結(jié)構(gòu)沒有差異。但令它們不解的是cDNA序列內(nèi)并沒有EcoRI和HindIII的切點，為什么會出現(xiàn)多條陽性帶。幾個月以后Berget，Sharp小組和Roberts小組同時發(fā)現(xiàn)了腺病毒外殼蛋白六聚體基因（Hexon gene）前導(dǎo)區(qū)有斷裂現(xiàn)象。他們用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII分別消解腺病毒的DNA，得到了大小不同的很多片段，分別選擇兩種酶切片段中的最大的A片段DNA和Hexon的mRNA進(jìn)行雜交，在電鏡下可以觀察到EcoRI酶切的

9、A片段的3段可以和上述mRNA形成雜合雙鏈，但在雜合雙鏈的5端逸出3個單鏈DNA環(huán)，說明它們不能和mDNA完全互補。他們的解釋是Hexon基因5端出現(xiàn)了斷裂，即有些區(qū)域在mRNA中已被刪除了，所以出現(xiàn)了不配對的單鏈環(huán)，而HindIII酶切的A片段是Hexon的3段區(qū)域，不含有這一斷裂區(qū)域，故不出現(xiàn)單鏈環(huán)。Berget在冷泉港作了有關(guān)發(fā)現(xiàn)斷裂基因的學(xué)術(shù)報告，提出在Hexon基因內(nèi)近5端有不編碼的部分。Chambon聽了報告后便意識到，他們的實驗結(jié)果也是可以用斷裂基因來解釋的。即卵清蛋白的基因上可能有多個斷裂區(qū)（內(nèi)含子）。在這些斷裂區(qū)上有酶切位點的存在，可將卵清蛋白基因切成大小不同的片段，但它們都

10、可以和mRNA進(jìn)行雜交。事后Chambon(1977,1981)等用Berget的實驗方法進(jìn)行了分子雜交，果然出現(xiàn)了7個單鏈DNA的環(huán)，表面有個斷裂區(qū)的存在，雖然錯過良機(jī)，但證實了自己的推測仍然是很值得稱贊的事。1977年繼Sharp和Roberts后相繼發(fā)現(xiàn)了兔子的b珠蛋白基因(Jeffregs.A.J和R.A.Flavell 1977)、鼠的b珠蛋白基因 (Leder P 1978) 和卵清蛋白基因(Chamber 1977)等的斷裂基因。1978年Gilbort創(chuàng)用了內(nèi)含子 (intro) 和外顯子 (exon) 兩個名詞，內(nèi)含子是指在成熟的mRNA中不出現(xiàn)的序列Exon是指在成熟的mR

11、NA中出現(xiàn)的編碼序列。內(nèi)含子的生物學(xué)意義在真核生物的基因中普遍存在著內(nèi)含子，既然它不編碼，那么其生物學(xué)意義何在？在長期的進(jìn)化過程中為什么它尚能保留安然無恙呢？Gilbert（1978年）指出：斷裂基因的存在可能有兩種意義：（1）有利于儲存較多的遺傳信息，如SV40的T和t蛋白；（2）有利于變異和進(jìn)化，若在交界序列處發(fā)生突變，就可能影響正常的剪切方式從而使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生較大的變化。除此之外內(nèi)含子還有以下的作用： 1. 有的內(nèi)含子可編碼內(nèi)切酶。酵母的細(xì)胞色素b基因含有3個外顯子(417bp，14bp和100bp)和兩個內(nèi)含子(765bp和1240bp)，轉(zhuǎn)錄成mRNA后首先切除了內(nèi)含子1，形成未成

12、熟的mRNA。核糖體結(jié)合在這種mRNA，利用外顯子1，2和內(nèi)含子2的部分序列（5端840Nt）為模板，翻譯成長為423aa的一種蛋白，叫成熟酶(maturase)，此酶回過頭來又可將未成熟的mRNA中的內(nèi)含子2切除掉，產(chǎn)生成熟的mRNA，最終以此mRNA為模板翻譯成細(xì)胞色素b（279aa）細(xì)胞色素bN端的144aa和成熟酶N端的144aa是同源的（圖10-44）。 另一個例子是酵母w蛋白內(nèi)含子的歸巢(Homing)。酵母中有兩種不同的品系w+和w, w+有內(nèi)含子，而w-在相應(yīng)的位置上無內(nèi)含子。若將w+品系和w-進(jìn)行雜交，按一般規(guī)律合子為w+/w-，經(jīng)減數(shù)分裂后應(yīng)產(chǎn)生2個w+孢子和2個w-的孢子

13、。但實際結(jié)果是所有的孢子都是w+。這是如何產(chǎn)生的呢？此是由于+品系的內(nèi)含子可以編碼一種內(nèi)切酶，在靶位點將w-基因的DNA切開，而此內(nèi)含子可以反轉(zhuǎn)錄成DNA雙鏈，插入到切開的靶位點上，連接后使w-變成了w+，這個過程就稱為內(nèi)含子的歸巢(Homing)。 2. 調(diào)控在內(nèi)含子的相對性中我們舉了SV40的T和t蛋白，以及大鼠肌鈣蛋白的兩種類型，從中可以看出真核基因組中雖然沒有重疊基因，但通過內(nèi)含子的相對性可使相同的一段DNA編碼不同的蛋白，起到了調(diào)控的作用，并增加了遺傳信息的儲存。 3. 提高進(jìn)化速率蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)與內(nèi)含子和外顯子的分布有密切的相關(guān)性。外顯子常常對應(yīng)于蛋白質(zhì)的折迭區(qū)域(protein

14、folding domains)或功能域(function domains)。如免疫球蛋白和b珠蛋白分子的各個結(jié)構(gòu)域和外顯子的分布是一致的。在進(jìn)化中，外顯子是穩(wěn)定的，內(nèi)含子的序列和長度是迅速隨機(jī)突變的。重組易發(fā)生在外顯子之間的內(nèi)含子之中，這樣可形成蛋白結(jié)構(gòu)域的新組合，而減少在外顯子上發(fā)生重組，若發(fā)生這樣的重組可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的破壞，內(nèi)含子的存在提高了有效重組。在原核生物中，沒有有性生殖的過程，不發(fā)生減數(shù)分裂，因此也不存在真核生物相互交換的同源重組，-只發(fā)生部分外基因子和完整內(nèi)基因子之間的單向重組。無論是轉(zhuǎn)化還是結(jié)合，無論是轉(zhuǎn)導(dǎo)還是轉(zhuǎn)座都發(fā)生在編碼區(qū)中，僅l噬菌體的整合發(fā)生在基因間的att位點

15、，這些重組往往會改變原核生物的性狀。原核生物諸多機(jī)能都傾向一個字：“變”。只有多變才能適應(yīng)環(huán)境的改變，抵抗宿主的限制和抗生素的作用。因此無內(nèi)含子是有利的。真核生物諸多機(jī)能都傾向于“穩(wěn)”。因在長期的進(jìn)化中，真核生物已產(chǎn)生了復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和各種系統(tǒng)適應(yīng)了環(huán)境，新的變化常常對生物是不利的。由于內(nèi)含子的存在，在此區(qū)發(fā)生的非法交換可以產(chǎn)生基因的重復(fù)，而進(jìn)化中形成了基因族及同工酶的基因，在原核生物的基因組中沒有內(nèi)含子就不可能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)基因的重復(fù)，因此也沒有基因家族和基因簇的存在。LDH基因的進(jìn)化也同樣是通過重復(fù)和突變產(chǎn)生的。由于在內(nèi)含子的存在在保留原有蛋白的同時，可產(chǎn)生一種新的蛋白，具有進(jìn)化優(yōu)勢。由于在外顯子和

16、內(nèi)含子的交界區(qū)發(fā)生突變，可產(chǎn)生新的5或3連接點，對于單個3位點來說可以和原來的5位點拼接，也可以和新的5位點結(jié)合，這樣產(chǎn)生的不同的mRNA既可以保留原有的蛋白，也可以產(chǎn)生一種新的蛋白，而原核生物基因突變只有在編碼區(qū)發(fā)生，這樣產(chǎn)生了新的蛋白，但原有基因的產(chǎn)物就不可能形成了。 內(nèi)含子是相對的，一個基因的內(nèi)含子可能是另一個基因的外顯子(如大鼠的肌鈣蛋白基因）。內(nèi)含子的相對性內(nèi)含子的生物學(xué)意義（1）有利于儲存較多的遺傳信息，（2）有利于變異和進(jìn)化,（3）有的內(nèi)含子可編碼內(nèi)切酶。（4）調(diào)控（ 5）提高進(jìn)化速率由于在內(nèi)含子的存在在保留原有蛋白的同時，可產(chǎn)生一種新的蛋白，具有進(jìn)化優(yōu)勢。內(nèi)含子歸巢(Homin

17、g) 酵母中有兩種不同的品系w+和w-, w+有內(nèi)含子，而w-在相應(yīng)的位置上無內(nèi)含子。+品系的內(nèi)含子可以編碼一種內(nèi)切酶，在靶位點將w-基因的DNA切開，而此內(nèi)含子可以反轉(zhuǎn)錄成DNA雙鏈，插入到切開的靶位點上，連接后使w-變成了w+，這個過程就稱為內(nèi)含子的歸巢(Homing)。4. 基因的重疊性與基因的可變性重疊基因： 重疊基因是指同一段DNA的編碼順序，由于 閱讀的框架不同或終止早晚的不同而可同時編碼兩個以上多肽的現(xiàn)象。一般常見于原核生物。 啟動子：啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5端上游的一段DNA序列，能夠與RNA聚合酶結(jié)合，啟動基因的轉(zhuǎn)錄。原核生物的啟動子：pribnow 框：在原核生物啟動子中，位

18、于轉(zhuǎn)錄起始位點上游10bp附近的六核苷酸序列(常常是TATAAT)，稱pribnow 框,又稱-10序列。決定基因轉(zhuǎn)錄的精確起始。 sextama 框: 對原核生物的大多數(shù)啟動子來說，在RNA聚合酶覆蓋的部分還有一個重要的區(qū)域，叫sextama 框，其位置在-35bp附近，因此又叫-35序列，其一致序列為：TTGACA。決定基因轉(zhuǎn)錄的效率。5. 啟動子、終止子、復(fù)制子真核生物的啟動子： Hogness 盒： 真核生物的基因中類似Pribnow框的共同序列(TATAAAAG) ，位于-25-30 bp處，也稱TATA框（box) ,又稱Hogness 盒（框、box）。 CAAT 框: 真核生物

19、中位于-75 bp附近有一段堿基序列為GGC(T)CAATCT的一致序列，稱CAAT 框（盒、 box），又稱-75序列。CAAT結(jié)構(gòu)是一種在真核生物啟動子中普遍存在的順式作用元件 。 YUE Chun-meiMING Zhen-huan ，HEREDITAS 2000 （College of Life Science,Zhejiang University ）SD序列（1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn)） 在原核生物中，mRNA中與核糖體16s rRNA結(jié)合的、一段富含嘌呤的核苷酸序列稱為SD序列，位于mRNA5端，一般位于mRNA的起始密碼子AUG上游5-10個堿基處，并同16

20、s rRNA的3端互補。幫助從起始AUG處開始翻譯。 終止子(terminator )： 是給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列。 復(fù)制子(replicon )： DNA 中能獨立復(fù)制的單位稱為復(fù)制子。復(fù)制的起始位點稱復(fù)制原點，復(fù)制的終點稱復(fù)制終點。 細(xì)菌、病毒、線粒體的DNA分子都是作為一個復(fù)制子完成復(fù)制的；真核生物的基因組可以同時在多個復(fù)制起始位點上開始雙向復(fù)制，因此含有多個復(fù)制子。二、基因克隆的通用策略切接轉(zhuǎn)增檢1.基本步驟2.亞克隆 克隆是指生物體通過體細(xì)胞進(jìn)行的無性繁殖，以及由無性繁殖形成的基因型完全相同的后代個體組成的種群?？寺∫部梢岳斫鉃閺?fù)制、拷貝，就是由原型生產(chǎn)出同樣的復(fù)制

21、品。 初步克隆的外源片段往往較長，含有許多目的基因片段以外的DNA片段，將目的基因所對應(yīng)的一小段DNA找出來稱為亞克隆?；蚬こ蹋╣enetic engineering): 狹義上講，基因工程是指將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿遺傳并表達(dá)出新的性狀。又稱DNA重組技術(shù)。 廣義上講，基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。三、基因工程的誕生、發(fā)

22、展及應(yīng)用基因工程操作的主要操作內(nèi)容1）目的基因的獲取2）重組體的制備 3）重組體的轉(zhuǎn)化 4）克隆鑒定 5）目的基因表達(dá) 1.基因工程誕生的理論基礎(chǔ)Gregor Mendel于1865年在“布隆自然歷史學(xué)會”上宣讀了他的植物雜交實驗論文，并于1866年發(fā)表于該會的會議錄上。 （1822-1884）35年之后，即1900年才被荷蘭的HDe Vries 、德國的CCorrens 和奧地利 ETschermak等植物學(xué)家重新發(fā)現(xiàn)。（1）遺傳因子 1909,丹麥 W.Johannsen(約翰遜)根據(jù)希臘文 “給予生命”之義創(chuàng)造了基因（gene）一詞 18571927 （18661945） 1910, 美

23、國THMorgan(摩爾根)創(chuàng)立了遺傳的染色體理論 （2） DNA是遺傳物質(zhì) a、 肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗 1944年 Avery，確定了基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì)。 b、 噬菌體轉(zhuǎn)染實驗 1952年Alfred Hershy和Marsha Chase進(jìn)一步證明遺傳物質(zhì)是DNA。（2） DNA是遺傳物質(zhì) a、肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗b、噬菌體轉(zhuǎn)染實驗1944年 Avery，確定了基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì)。1952年Alfred Hershy和Marsha Chase進(jìn)一步證明遺傳物質(zhì)是DNA。 1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了D

24、NA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)制。 （3） DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) （4）中心法則和遺傳密碼 1957年Crick又提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”DNARNAProtein1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等終于破譯了64個遺傳密碼 2、基因工程誕生的技術(shù)突破 (1). 限制性內(nèi)切酶（restriction enzymes） 1978年Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎 (2). DNA連接酶（ligase） 1967年發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。 H.O.Smith 和Wilox于1970年首次從流感嗜血桿菌（H. influenzae）中發(fā)現(xiàn)并分離HindII限制酶。H.O.Smith細(xì)菌限制修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)Werner Arber于1962-1968年發(fā)現(xiàn)，1968年分離到I型限制酶。限制酶HindII的發(fā)現(xiàn)H.O.Smith 和Wilox于1970年首次從流感嗜血桿菌（H. influenzae）中發(fā)現(xiàn)并分離HindII限制酶。SV40 限制圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜的繪制D.Nathans（1971年）用HindII繪制SV40的限制酶譜。(3). 載體（vector）1972年前后使用小分子量的細(xì)菌質(zhì)粒和噬菌體作載體。在細(xì)菌細(xì)胞里的大量擴(kuò)增。 (4). 感受態(tài)體系 1970年M. Mandel和A. Higa發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氯化鈣處理的大腸桿菌容