基因克隆載體 (2)講稿

1、關(guān)于基因克隆載體 (2)第一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基因克隆載體的特點(diǎn)具備與外源DNA片段連接和重組的克隆位點(diǎn)進(jìn)入受體細(xì)胞后能穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中或與染色體整合在一起在宿主細(xì)胞或受體細(xì)胞中自我復(fù)制或隨整合的受體細(xì)胞染色體DNA一起復(fù)制外源基因能在受體細(xì)胞中表達(dá)克隆載體進(jìn)入細(xì)胞后有可供選擇標(biāo)記第二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 克隆載體的分類質(zhì)粒載體 大腸桿菌質(zhì)粒載體，枯草桿菌質(zhì)粒載體，酵母質(zhì)粒載體，農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體，藍(lán)細(xì)菌質(zhì)粒載體噬菌體質(zhì)粒載體 雙鏈DNA噬菌體載體： 單鏈DNA噬菌體載體：M13，T3，T7病毒載體 植物病毒載體CaMV（花椰菜花斑病病毒） 動(dòng)物病毒

2、載體 SV40（猿猴空泡病毒）2.1 按構(gòu)建克隆載體DNA的來源分類第三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒和噬菌體DNA兼有的載體 Phasmid 載體（含有f1 噬菌體的ori） Cosmid 載體（含有DNA的Cos區(qū)）染色體和質(zhì)粒DNA兼有的載體（Chrosmid vector） 基因整合平臺(tái)系統(tǒng) 克隆載體其它克隆載體第四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.2 按克隆載體的用途分類 cDNA克隆載體：gt11，pT7T3 原核（Prokaryotic）表達(dá)載體：pKK223-3 原核基因融合（Prokaryotic gene fusion）載體： pGEX-2T，p

3、GEX-3X 真核（Eukaryotic）表達(dá)載體：pSVK3，pBPV 轉(zhuǎn)錄（Transcription）載體：pSL1190 普通載體（General vector）：pBR322，pUC18第五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 質(zhì)?？寺≥d體 質(zhì)粒載體的一般特性質(zhì)粒是一種廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中染色體以 外的能自主復(fù)制的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡(jiǎn)單。在霉菌、藍(lán)藻、酵母和一些動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對(duì)細(xì)菌的質(zhì)粒研究得比較深入。第六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒載體的一般特性 質(zhì)粒的組成與構(gòu)型 細(xì)胞內(nèi)：超螺旋環(huán)狀共價(jià)雙鏈DNA分子 細(xì)胞外：超螺旋、開

4、環(huán)，線形 雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋）開環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口）線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口）第七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 質(zhì)粒DNA分子的大?。杭?xì)菌質(zhì)粒的大小相差較大，小的僅不足1kb，大的可達(dá)數(shù)百kb. 不相容性（Incompatible）：兩種類似的但又不同的質(zhì)粒不能存在于同一細(xì)胞中 可轉(zhuǎn)移性：質(zhì)粒可通過接合作用等方式轉(zhuǎn)移到新的宿主細(xì)胞中 復(fù)制性：質(zhì)粒DNA分子只在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行單向復(fù)制，其復(fù)制受質(zhì)粒本身和宿主細(xì)胞遺傳系統(tǒng)的雙重控制，質(zhì)粒提供復(fù)制的起始位點(diǎn)和核苷酸的序列 第八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月6）相關(guān)基因 A）COP因子：決定質(zhì)粒的拷貝數(shù)，在質(zhì)粒的復(fù)制過程中指

5、令細(xì)胞合成阻物，當(dāng)質(zhì)粒復(fù)制到一定的拷貝時(shí)，阻物的量也積累到足以阻止質(zhì)粒的復(fù)制B）Rep基因：在質(zhì)粒的復(fù)制過程中，Replication基因會(huì)指令宿主細(xì)胞合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)質(zhì)粒的復(fù)制C）Inc基因：決定兩種親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒不能存在于同一宿主細(xì)胞中D）Tra基因：指令宿主細(xì)胞合成菌毛（Pilus）和細(xì)胞表面物，促使宿主細(xì)胞與受體細(xì)胞表面結(jié)合，遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，TcrF）產(chǎn)毒素基因：大腸桿菌素基因（Col-質(zhì)粒）G）降解基因：降解重金屬、有機(jī)物和農(nóng)藥等H) 致瘤基因：誘導(dǎo)某些組織形成腫瘤，如Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒 第九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月

6、 幾種常見的質(zhì)粒載體）pBR322：含有雙抗基因（Apr，Tcr）Col E1 復(fù)制起始子 第十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和復(fù)制的起始點(diǎn)，部分缺失的Lac操縱子片段，并在Lac Z區(qū)組裝了MCS 第十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月pUC 18-19多克隆位點(diǎn)第十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3）pBluescript M13： 含有M13噬菌體DNA復(fù)制起點(diǎn)的載 體，該起點(diǎn)以互為相反方向插入到含有T3和T7噬菌體啟動(dòng) 子的一個(gè)來自pUC質(zhì)粒的載體當(dāng)中 第十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月p

7、Bluescript M13多克隆位點(diǎn)第十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4）Ti質(zhì)粒載體第十五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月病毒區(qū)基因及功能第十七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Ti質(zhì)粒T-DNA的邊界序列第十八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 質(zhì)粒載體的構(gòu)建1）構(gòu)建的質(zhì)粒載體能轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞,并在其中進(jìn)行松弛型復(fù)制. * 選擇松弛型質(zhì)粒復(fù)制起始子(Ori)2) 構(gòu)建的質(zhì)粒載體含有克隆外源DNA的位點(diǎn)(MCS) *構(gòu)建的質(zhì)粒載體含有選擇標(biāo)記基因(Apr,Tcr,Kmr) *構(gòu)建的質(zhì)粒載體分子量小,轉(zhuǎn)化效

8、率高,插入外源片段較大. 3.1 質(zhì)粒構(gòu)建的基本要求第十九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3.2 pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建第二十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月.3 pUC18-19 質(zhì)粒載體的構(gòu)建以pBR322為出發(fā)質(zhì)粒，用含乳糖操縱子O、P和Z的DNA片段取代pBR322上的Tcr基因，并在Z區(qū)組入一個(gè)多克隆位點(diǎn)第二十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月pUC18-19的構(gòu)建第二十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 藍(lán)藻質(zhì)粒載體的構(gòu)建 藍(lán)藻作為受體細(xì)胞的特點(diǎn) a）原核生物，能進(jìn)行光合作用，具有固氮能力 b）基因組簡(jiǎn)單，50%的藍(lán)藻含有質(zhì)粒 c）細(xì)

9、胞大（10-10于E.coli）儲(chǔ)藏蛋白多，單一蛋白可達(dá) 25%，而大腸桿菌僅為5% d）蛋白更新慢，容受性比較大 e）蛋白酶的降解作用比較低，產(chǎn)物比較均一 藍(lán)藻質(zhì)粒的特點(diǎn) a）雙向載體（需要兩種Ori） b）合適的選擇標(biāo)記 c）分子大小合適 d）拷貝高第二十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月藍(lán)藻質(zhì)粒載體pAQE17的構(gòu)建第二十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)原理: 保留T-DNA兩側(cè)的邊界序列,插入選擇 性標(biāo)記,除去致瘤基因和無(wú)關(guān)基因.共整合質(zhì)粒載體: 將T-DNA區(qū)段編碼致瘤基因和 冠癭堿合成酶的基因由pBR322上的一段DNA片段取

10、代,當(dāng)攜帶目的基因片段的pBR322衍生中間載體進(jìn)入農(nóng)桿菌細(xì)胞后,兩者相同的pBR322序列之間發(fā)生同源交換,導(dǎo)致外源目的基因片段整合到Ti質(zhì)粒上.第二十五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 外源片段共整合到Ti質(zhì)粒上的過程第二十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雙向載體：由兩個(gè)以上的質(zhì)粒構(gòu)建而成. 將Ti質(zhì)粒的Vir與廣宿主范圍質(zhì)粒的攜帶目的基因(MCS)、選擇性標(biāo)記、轉(zhuǎn)移和復(fù)制功能整合在一起.雙向載體可在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中進(jìn)行復(fù)制并穩(wěn)定存在下去雙向Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建第二十七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 噬菌體衍生的克隆載體.1噬菌體的一般特性 噬菌體的

11、組成 結(jié)構(gòu)：外殼蛋白 DNA 形態(tài)：頭部 尾部 噬菌體克隆載體第二十八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體的電子顯微鏡照片第二十九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 a) 在噬菌體內(nèi)呈線性雙鏈DNA分子(48502bp) 在兩端各有12個(gè)堿基組成的5單鏈互補(bǔ)粘 性末端(Cohesive end ),進(jìn)入宿主細(xì)胞后, 粘性末端連接形成環(huán)狀分子(Cos位點(diǎn)) 5-GGGCGGCGACCTXXXXG-3 XXXXCCCCGCCGCTGGA-5 b) 基因組DNA上有多種限制酶識(shí)別位點(diǎn) c) 噬菌體包裝DNA的大小為原DNA長(zhǎng)度的 75-105%( 38-54 kb)基因組DNA的

12、特點(diǎn)第三十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.2 基因組DNA的結(jié)構(gòu)第三十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體的組裝第三十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.3 噬菌體載體構(gòu)建的策略a)去除部分限制酶識(shí)別位點(diǎn)b)去除非必需區(qū)DNAc)插入可供選擇的標(biāo)記基因第三十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常用的噬菌體衍生載體載體名稱 分子大小(kb) 可克隆外源DNA片段大小(kb) Charon 3A 4.83 0 21.4 Charon 4A 4.54 0 20.1 Charon 17 4.64 0 - 22.4 Charon 20 40.36 0 21

13、.37 Charon 21 A 41.7 0 21.08 Charon 28 39.39 0 20.05 Charon 30 46.76 0 - 20.24 LA 7 1 40.6 0 24.1 Sep6-lac 5 44.3 0 22.4 BF 101 46 .0 6.3 24.4第三十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. Cosmid克隆載體2.1 Cosmid載體的特點(diǎn) a)兼有噬菌體和質(zhì)粒載體的特點(diǎn)含有噬菌體Cos位點(diǎn)(可進(jìn)行體外包裝)和細(xì)菌質(zhì)粒載體的復(fù)制子(選擇標(biāo)記, 可在細(xì)菌中保存和大量復(fù)制) b)可插入大片段外源DNA第三十五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月

14、2.2 部分Cosmid載體Cosmid載體 復(fù)制子 分子量(kb) 選擇標(biāo)記 克隆位點(diǎn) 克隆能力(kb)C2XB pMB1 6.8 Apr , Kmr Bam HI,Cla I, EcoRI 32 - 45 Hind III, Pst I, Sma I pHC79 pMB1 6.4 Apr, Tcr EcoR I, Hind III, Sal I 29 - 46 BamHI, Pst I, Cal IpHS262 Col E1 2.8 Kmr Bam HI, EcoR I, HincII 34 46pJC74 Col E1 15.8 Apr EcoR I, BamHI, Sal I 21 3

15、7pJB8 Col E1 5.4 Apr BamHI, Hind III, Sal I 31 47MUA-3 pMB I 4.8 Tcr Pst I, EcoR I, Bal I 32 - 48pTL 5 pMB I 5.6 Tcr Bgal I, Bal I, Hpa I 31 47pMF7 pMB I 5.4 Apr EcoR I, Sal I 32 48第三十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. M13衍生的克隆載體3.1 M13噬菌體的特點(diǎn) * 環(huán)狀單鏈DNA(6407堿基),可轉(zhuǎn)導(dǎo)E.coli * 含有基因間隔區(qū)(IS-Inter sequence) * 具有轉(zhuǎn)染作用(E

16、.coli)第三十七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3.2 M13 DNA的復(fù)制與M13噬菌體的增殖 a) M13噬菌體吸附在大腸桿菌表面F性毛上, M13 ss-DNA(+鏈)進(jìn)入細(xì)胞 b) 在宿主細(xì)胞內(nèi)以+鏈為模板合成大量的-DNA 鏈,成為雙鏈復(fù)制型DNA(RF-DNA),同時(shí)在宿 主細(xì)胞內(nèi)合成大量的特異性蛋白與+鏈DNA 結(jié)合 c) RF-DNA 以-DNA為模板不斷合成+鏈DNA, 與特異性蛋白結(jié)合,組裝成新的噬菌體顆粒. 釋放到細(xì)胞外,而不破壞宿主細(xì)胞第三十八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3.3 M13 衍生的克隆載體第三十九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于202

17、2年6月第四節(jié) 植物病毒載體1.花椰菜花斑病病毒（Cauliflower Mosaic Virus, CaMV) 環(huán)狀雙鏈DNA病毒，由蚜蟲以非持久方式或半持久方式傳播、感染十字花科和少數(shù)非十字花科植物 第四十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1）CaMV-DNA的一般特性 環(huán)狀雙鏈DNA（8031bp），在病毒顆粒中 以開環(huán)的形式存在，分別在-鏈上有一個(gè)缺口 (1），+鏈上有兩個(gè)缺口（2， 3），在缺口中形成三鏈結(jié)構(gòu)第四十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月花椰菜花斑病病毒DNA缺口的結(jié)構(gòu)缺口1： GA ATTT TTT AA 5 3 GC ATTT TTT AA 5 5 C

18、GCT TAAAAAATT 3缺口2：5 GGTTGATTACTCGAGCC 5 GGTTGATTACTCGAG AA 3 3 CCAACTAATGAGCTCGGTT 5缺口3：5 TCCAATAGTCT TC TTTTT CAG 5 TCCAATAGTCT TC TTTTT G AA 3 3 AGGTTATCAGAAGAAAAACTCTT 5 第四十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月CaMV DNA分子上有八個(gè)開放閱讀框（ORF)和三個(gè)間隔區(qū) ORF I：編碼運(yùn)動(dòng)蛋白，負(fù)責(zé)CaMV在細(xì)胞間運(yùn)轉(zhuǎn) ORF II：表達(dá)產(chǎn)物與蚜蟲口針或前腸的特殊位點(diǎn) 相結(jié)合，參與蚜蟲的感染 ORF III

19、：編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白 ORF IV：編碼反轉(zhuǎn)錄酶2) CaMV基因區(qū)第四十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月病毒增殖缺口閉合侵染編碼病毒反轉(zhuǎn)錄酶，35S反轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)癥狀和宿主范圍編碼外殼蛋白 花椰菜花斑病病毒基因組DNA的結(jié)構(gòu)第四十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3)CaMV DNA的間隔區(qū) IR 1：位于ORF VI和ORF VII之間， 長(zhǎng)度為 700 bp，含有啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄35S RNA的啟動(dòng)子 IR 2：位于ORF VII和ORF I之間，長(zhǎng)度為60bp IR 3：位于ORF V和ORF VI之間，長(zhǎng)度為60bp， 含有啟動(dòng)19S RNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子第四十五張，PPT共九

20、十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月CaMV 35S啟動(dòng)子序列第四十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4）CaMV-DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)在CaMV-DNA的非必需區(qū)（II區(qū)和VII區(qū)）含有限制酶識(shí)別位點(diǎn)（如BstE II和Xho I），這些單酶切位點(diǎn)可用于插入外源DNA片段第四十七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月CaMV（Cabb B-S）DNA的部分酶切位點(diǎn)第四十八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5）CaMV-DNA的存在狀態(tài)與感染能力 DNA 狀態(tài) 傷口感染 CaMV + CaMV-DNA + CaMV-DNA-單酶切 + CaMV-DNA-雙酶切 5% CaM

21、V-DNA-雙酶切-插入DNA - CaMV-DNA+克隆載體 - 第四十九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月6）CaMV的轉(zhuǎn)錄復(fù)制與CaMV的增殖第五十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月7)CaMV-DNA克隆載體的構(gòu)建 基本策略和要求 * 利用病毒對(duì)宿主細(xì)胞感染的特性 * 利用DNA分子上的單酶切位點(diǎn) * 替換非必需區(qū) * 高拷貝地存在于植物細(xì)胞中第五十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月互補(bǔ)載體系統(tǒng)由缺陷型CaMV-DNA分子(攜帶外源目的基因) +輔助CaMV-DNA分子(攜帶缺陷型感染所需的基因) 共同感染 進(jìn)入植物細(xì)胞并表達(dá)缺點(diǎn): 突變體之間發(fā)生重組,重新產(chǎn)

22、生野生型CaMV第五十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 混合載體系統(tǒng)將CaMV-DNA整合到Ti質(zhì)粒DNA分子上,使新的載體同時(shí)具有CaMV和Ti載體的特性. 通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中. 特點(diǎn): * 擴(kuò)大了CaMV的正常宿主范圍 * 避免了CaMV突變體之間的基因重組第五十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 煙草花葉病毒（TMV)克隆載體 煙草花葉病毒為短桿狀，基因組為單鏈RNA，長(zhǎng)為6395個(gè)堿基，包括四個(gè)閱讀框 ORF 1：編碼126kD蛋白質(zhì)，參與病毒復(fù)制 ORF 2：編碼183kD蛋白質(zhì)，參與病毒復(fù)制 ORF 3：編碼移動(dòng)蛋白（MP)，分子量（30kD）

23、 ORF 4：編碼病毒外殼蛋白（CP, 17.5kD）第五十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月TMV 的 結(jié) 構(gòu) 特 征第五十五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月TMV克隆載體構(gòu)建的策略第五十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第五節(jié) 動(dòng)物病毒基因克隆載體 1.猿猴空泡病毒40（ Simian virus 40，SV40) 第五十七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1)SV40 DNA的一般特性 SV40 DNA為環(huán)狀雙鏈DNA（5243bp），與宿主細(xì)胞組蛋白H4，H2A，H2B和H3結(jié)合，組成念珠狀核小體-微型染色體（mini-chromosome） S

24、V40 DNA編碼兩個(gè)基因區(qū)，早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)，分別以相反的方向轉(zhuǎn)錄第五十八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月SV40基因轉(zhuǎn)錄圖第五十九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月SV40 DNA單識(shí)別位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) 限制性內(nèi)切酶 識(shí)別位點(diǎn) Kpn I 294 Nae I 343 Hpa II 346 Hae II 832 EcoR I 1782 BamH I 2533 BstX I 2759 Taq I 4739 Bgl I 5235第六十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2） SV40-DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制與增殖 SV40 感染并進(jìn)入細(xì)胞 病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞核 進(jìn)行

25、早期轉(zhuǎn)錄，合成T抗原 啟動(dòng)病毒DNA復(fù)制 晚期轉(zhuǎn)錄，合成包裝蛋白 組裝成病毒顆粒，細(xì)胞裂解第六十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3） SV40 DNA衍生的克隆載體的構(gòu)建 構(gòu)建SV40 DNA衍生克隆載體的策略 a) 保留完整的T-抗原基因. b) 保留復(fù)制起始點(diǎn)(Ori), 間隔區(qū)和終止序列 c) 替換晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因.第六十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月SV 40 DNA晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)取代型載體第六十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月SVGT5-RG- SV40病毒晚期區(qū)段取代載體第六十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月重組病毒質(zhì)粒載體含有完整早期區(qū)

26、段和復(fù)制起始點(diǎn)的病毒質(zhì)粒載體第六十五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 腺病毒克隆載體 腺病毒（adenovirus）是一類無(wú)囊膜的20面體病毒，含有一個(gè)線性雙鏈DNA分子在每一條單鏈DNA的5端共價(jià)結(jié)合一種特殊結(jié)合蛋白（5.5 kD），當(dāng)DNA從病毒顆粒中釋放后，通過該蛋白連接成環(huán)狀第六十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月腺病毒結(jié)構(gòu) 第六十七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月腺病毒DNA的結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白反向重復(fù)序列第六十八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月腺病毒克隆載體的構(gòu)建第六十九張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié) 反轉(zhuǎn)錄病毒衍生的克隆載體

27、 反轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus)是一類含RNA的病毒感染到動(dòng)物細(xì)胞后，病毒RNA通過反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DNA分子，可整合到宿主細(xì)胞染色體上或成為原病毒，隨染色體DNA進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯第七十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)1）RSV基因組的特點(diǎn) 基因組由四條RNA分子構(gòu)成， 兩條38S RNA編碼病毒的全部遺傳信息，兩條較小的RNA分子為宿主細(xì)胞的tRNATrp 38 S RNA鏈帶有兩段相同的r序列的非編碼區(qū)，分別位于5-末端和3-末端.第七十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月RSV病毒RNA分子結(jié)構(gòu)（非編

28、碼序列）被膜基因聚合酶基因抗原基因第七十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2）RSV病毒的復(fù)制與原病毒DNA的轉(zhuǎn)錄翻譯第七十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3)反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體構(gòu)建策略 a）從感病細(xì)胞中分離原病毒DNA. b）根據(jù)不同需要引入選擇標(biāo)記、外源基因及 DNA 復(fù)制的啟動(dòng)子. c）與質(zhì)粒載體重組構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體 d）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞E.Coli e）包裝成新的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒. f）感染目的宿主細(xì)胞（動(dòng)物細(xì)胞），外源基 因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞.第七十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六節(jié) 基因定位整合克隆載體 為了保證外源DNA在細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳并不對(duì)宿主細(xì)

29、胞的代謝產(chǎn)生較大的影響，建立基因整合平臺(tái)系統(tǒng)，使外源基因定位整合到染色體特定的位點(diǎn)它包括整合平臺(tái)和整合克隆載體兩部分 整合平臺(tái)：受體細(xì)胞基因組上給定的DNA區(qū)域 整合克隆載體：含有一個(gè)或兩個(gè)與整合平臺(tái)區(qū)核苷酸序列同源的DNA片斷 第七十五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月外源DNA整合到染色體上第七十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.定位整合克隆載體的種類1) 內(nèi)源平臺(tái)雙交換置換克隆載體 第七十七張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2) 外源平臺(tái)雙交換置換克隆載體第七十八張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3) 內(nèi)源平臺(tái)雙交換插入克隆載體第七十九張，PPT共九

30、十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4) 內(nèi)源平臺(tái)單交換插入克隆載體第八十張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 整合克隆載體的整合效率 基因定位整合的效率與受體細(xì)胞的種屬和同源DNA片斷的長(zhǎng)短有關(guān) 鼠胚胎干細(xì)胞hprt基因整合平臺(tái)系統(tǒng)定位整合效率第八十一張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3.定位整合克隆載體的應(yīng)用藍(lán)藻染色體定位整合克隆載體酵母染色體定位整合克隆載體植物染色體定位整合克隆載體動(dòng)物染色體定位整合克隆載體第八十二張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第七節(jié) 酵母人工染色體（YAC）克隆載體人工酵母染色體（Yeast Artificial Chromosome） a）保持

31、染色體穩(wěn)定所必需的順式作用因子被 確定 b）建立了酵母高效表達(dá)系統(tǒng) c）建立了大片段DNA分離的方法（脈沖場(chǎng)凝膠電泳）目的：用于克隆大于100 kb的基因組DNA某些 基因如人凝血因子VII基因長(zhǎng)達(dá)180kb，肌 營(yíng)養(yǎng)不良基因大于1800 kb第八十三張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. pYAC4人工染色體 第八十四張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2YAC克隆載體的應(yīng)用1）構(gòu)建基因組文庫(kù)或克隆外源基因利用YAC構(gòu)建基因組文庫(kù)或克隆外源基因的過程類似于原核生物基因組文庫(kù)的構(gòu)建和DNA的克隆過程，通過酶切、酶連和轉(zhuǎn)化等一系列過程在含有單臂或雙臂所需成分的瓊脂糖平板上鑒定保持人工染色體的酵母染色體當(dāng)DNA插入到克隆位點(diǎn)后，打斷了抑制型tRNA基因，致使帶ade 琥珀突變基因的酵母株形成紅色而不是白色的菌落第八十五張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月利用YAC構(gòu)建基因組文庫(kù)或克隆外源基因第八十六張，PPT共九十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月YAC克隆基因中的注意事項(xiàng) 基因組在剪切力相對(duì)較小的環(huán)境中制備，以得 到平均數(shù)千kb的DNA片段 以稀切限制酶