核酸檢測的室內質量控制（新冠肺炎核酸檢測學習專家課堂）

1、核酸檢測的室內質量控制新冠疫情席卷全球全球累計確診1413萬，死亡60萬新冠病毒核酸檢測是COVID-19診斷金標準如何保證檢測質量發(fā)出準確可靠的檢測報告？室內質量控制（internal quality control, IQC） 是指在實驗室內部實驗室工作人員對所有影響質量的 每一個環(huán)節(jié)進行系統控制，評價本實驗室工作的可靠 性，監(jiān)測和控制本實驗室工作的精密度，提高常規(guī)工 作中批內、批間檢驗結果的一致性，以確定檢測結果 是否可靠、有效，能否發(fā)出報告的一項工作。室內質量控制的概念IQC的主要內容實驗室環(huán)境設 施人員資質及培 訓儀器設備與管 理試劑耗材與質 檢SOP文件樣本采集運送 與接收保存分析

2、前質量控制分析中質量控制核酸提取核酸擴增產物檢測統計學質量控制Levey- Jennings質 控圖方法假陽性、假陰 性的統計質控 方法失控原因分析和 IQC評價分析失控原因預防假陽性、 假陰性發(fā)生的 措施IQC評價分析前質量控制實驗室資質要求病原微生物實驗 室生物安全管理條 例國務院令第 424號醫(yī)療機構臨床基 因擴增檢驗實驗室 管理辦法衛(wèi)辦醫(yī) 政發(fā)2010194號管理 文件生物安全二級及以 上實驗室臨床基因擴增檢驗 實驗室資質 要求獨立的醫(yī)學檢驗實驗室：醫(yī)學檢驗實驗室基本標準（試行）醫(yī)學檢驗實驗室管理規(guī)范（試行）實驗室環(huán)境及設施試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、產物分析區(qū)嚴格控制空氣流

3、向，以防止擴增產物順空氣氣流進入擴增前區(qū)域分區(qū)合理控制氣流人員資質與培訓崗位勝任力 不斷提升持續(xù)的外 部培訓持續(xù)的內部培訓臨床基因擴 增檢驗培訓 合格儀器設備與管理功能檢查維護校準正確使用檢測方法性能驗證性能 驗證準確 度精密 度靈敏 度特異 性檢測 限試劑耗材質檢試劑盒質檢：內外包裝檢查、檢測性能檢驗 耗材質檢：抑制物檢驗、氣密性檢驗SOP文件SOP文件的主要內容實驗室清潔；生物安全防護；儀器設備的操作；儀器設備的維護和校準；臨床標本的采集、運送、接收和保存；試劑盒和耗材的質量檢驗；項目檢測、結果判斷和報告；實驗記錄及其管理；室內質量控制；室間質量評價；投訴處理等方面。表格和記錄SOP程序文

4、件質量手冊SOP范例實驗室的清潔、去污染工作物理、化學的方法破壞核酸儀器桌面臺面地面空氣重復使用 的耗材等樣本的采集、運送、接收和保存采集標本類型下呼吸道標 本鼻咽拭子口咽拭子糞便等采集管類型病毒保存管RNA保存管送運盡快送檢密閉運送接收制度嚴格的簽 收制度拒收不合格標 本標本太少溢灑樣本類型與 條碼不符容器破損用錯采樣管 等保存24h內檢測， 4保存放24h以上， 置于-70保 存，避免反復 凍融分析中質量控制核酸提取的有效性評價核酸濃度和純度檢測核酸完整性檢測樣本保存液、核酸提取試劑應與核酸擴增試劑配套。有些核酸提 取試劑易受胍鹽或保存液中特殊成分的影響，影響核酸提取效果。標本質量及擴增檢

5、測有效性的質控措施內標監(jiān)測樣本是 否合格樣本是否存 在擴增抑制 物或干擾物檢測過程是否有效新冠檢測常試劑空白監(jiān)測試劑質 量配制試劑時 是否發(fā)生污 染陰性質控監(jiān)測是否發(fā) 生污染（假 陽性）實驗室既往 檢測的陰性 樣本或水建議使用不 帶內標的質控品弱陽性質控檢測假陰性 的發(fā)生大大提高檢 測操作變異 的靈敏度一般為檢測 限的3倍建議使用不帶內標的質 控品陽性質控檢測假陰性 的發(fā)生建議使用不 帶內標的質 控品內標污染統計學質量控制驗室工作的精 密度1用統計學方法發(fā)現誤差的產生及產生原因監(jiān)測和控制實學方法分析判斷質控品的檢 驗結果是否在 允許范圍內， 判斷檢測結果 是否有效2檢測樣本時，同時檢測質控品，

6、采用統計3是IQC的核心常用Levey-Jennings質 控圖方法假陽性的統計質控方法Levey-Jennings質控圖法3s2s 1s x測定批次根據日常患者結果陽性率的 Levey-Jennings質控圖進行判斷陽性率超過+2s，報警，符合1+2s 規(guī)則。連續(xù)三次檢測中有兩次報警，則為 “污染”監(jiān)測失控，符合3+2s規(guī)則。某次檢測陽性率超過+3s，失控， 符合1+3s規(guī)則。陰性質控品陽性，失控。發(fā)生（假陽性）失控，如何處理陽性結果不能發(fā)，查找原因，重做所有陽性樣本，增加1倍陰性質控樣本陰性結果根據陽性質控樣本的結果決定是否發(fā)出分析當天檢測人群組成與平常是否有差異，明確是否有潛在的污染發(fā)生

7、， 是否是假失控假陽性的統計質控方法直接概率計算法如果某項目檢測的陽性率非正態(tài)分布，則采用此方法。按統計學規(guī)律，一個事件發(fā)生的概率5%被稱為小概率事件，即發(fā)生的可 能性很小。當發(fā)生小概率事件時，可能有誤差存在。當某事件發(fā)生的概率5%，判斷為失控。計算方法：根據二項式分布計算概率：適用于陽性率較高的項目。檢測項目的陽性 率為p，n個患者中有k個陽性結果的概率Px=k=n!/k!(n-k)!pk(1-p)n-k, Px=k5%為失控根據泊松分布計算概率：適用于陽性率較低的項目 Px=k=(np)ke-np/k!直接概率的計算方法根據二項式分布計算概率：適用于陽性率較高的項目。檢測項目的陽 性率為p

8、，n個患者中有k個陽性結果的概率Px=k=n!/k!(n-k)!pk(1-p)n-k, Px=k5%為失控根據泊松分布計算概率：適用于陽性率較低的項目 Px=k=(np)ke-np/k!樣本間交叉污染的概率：如果所有陽性樣本的出現是連續(xù)性的，可能 存在標本間的交叉污染，交叉污染的概率P的計算公式P=(n-r+1)/n!/r!(n-r)!(r為連續(xù)出現陽性的個數）。如果實際測定的樣本連續(xù)陽性的概率大于所計算的概率，判斷為失控。舉例：樣本間交叉污染的概率計算一次檢測100個樣本的HBV DNA，2個陽性結果連續(xù)出現的概率為： P=(100-2+1)/100!/2!(100-2)!=99/4950=

9、0.02，即2%如果在100個樣本中連續(xù)出現2個陽性樣本的次數有3次，即概率為3%， 則為失控，提示存在樣本間的交叉污染。3個陽性結果連續(xù)出現的概率為：P=(100-3+1)/100!/3!(100-3)!=98/161700=0.0006，即0.06%如果在100個樣本中連續(xù)出現3個陽性樣本的次數有1次，即概率為1%， 則為失控，提示存在樣本間的交叉污染。假陰性的統計學質控方法可 參考假陽性的統計學質控方法失控原因的分析臨床樣本靶標和 內標陰性樣本取樣不 合格樣本中存在 核酸檢測抑 制劑或干擾 劑檢測失敗， 原因分析同 陽性質控品 失控無內標質控品內 標陽性(內標污染)陰性質控品失控假陽性

10、假陽性擴增產物污 擴增產物污 染染樣本交叉污 樣本交叉污 染染試劑污染 試劑污染帶內標的陽 基因組或質 性質控品污粒DNA污染染（陽性質控品污染）陽性質控品失控檢測結果（Ct值降 低）或假陰 性試劑問題儀器問題核酸提取過 程中的隨機 誤差陰性質控樣本失控的原因分析流程李金明（第2版）. 實時熒光PCR技術. 科學出版社, 2016.換用不同的核 酸檢測試劑預防陰性質控品失控的措施（避免假陽性）實驗室管理嚴格分區(qū) 控制氣流遵循實驗 室工作原 則嚴格按 SOP操作化學試劑去 除污染源次氯酸鈉 溶液70%乙醇核酸清除 劑8% H2O2、過氧乙酸對擴增產物 進行修飾紫外線照 射尿嘧啶- N-糖基化 酶

11、(UNG)一般方法一次性耗 材帶濾芯的 吸頭大小合適 的手套勤換手套陽性質控樣本失控的原因分析流程陽性質控品失控的常見原因及處理方法Taq酶失活逆轉錄酶失 活核酸提取試 劑失效試劑問題儀器問題擴增儀孔間 溫度不一致孔內溫度與 所顯示的溫 度不一致核酸提取過程中的隨機誤差耗材質量問 題，如有抑 制物提取過程中 核酸丟失有機溶劑去 除不徹底更換試劑校準儀器更換耗材、重新檢測處理措施預防陽性質控品失控的措施（避免假陰性）稀釋樣本樣本含已知抑 制物如肝素、 血紅蛋白，且 靶核酸濃度足 夠檢測純化核酸避免樣本中的 抑制物干擾可采用酚-氯仿 提取、磁珠法 提取、二氧化 硅吸附等方法 分離純化核酸重復雙份檢測避免由于操作 的隨機性導致 純化的核酸樣 本中混入去垢 劑和有機溶劑 等使用內質控避免因試劑、 擴增儀或標本 處理不當導致 的假陰性如果靶標濃度 很高，可致靶 核酸和內標間 產生競爭，使 內標受抑制， 此時可為陰性。室內質量控制數據的評價復核質控 數