鼠HMGB1蛋白的原核表達(dá)及分離純化

1、鼠HMGB1卵白的原核表達(dá)及分散純化趙中夫楊慧劉明社張蕓楊柳絮封江南【關(guān)鍵詞】高遷徙率族卵白1；原核表達(dá)載體；純化摘要目的：克隆小鼠HGB1基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)并分散純化得到His-HGB1的交融卵白。要領(lǐng)：脂多糖刺激后的RA264.7細(xì)胞，提取總RNA，經(jīng)RT-PR擴(kuò)增出含HGB1的目的片斷，克隆于pD-19T載體，再亞克隆至含有pelB引導(dǎo)肽及His-標(biāo)簽肽的高效表達(dá)載體pET-26b(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后行SDS斷定目的卵白表達(dá)，用鎳鰲合瓊脂糖凝膠親和層析法分散純化含His-標(biāo)簽肽的目的卵白。效果：經(jīng)PR擴(kuò)增出巨細(xì)為648bp的HGB

2、1基因片斷，樂成構(gòu)建目的卵白的交融表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)及分散純化，得到了約30kD的交融卵白。結(jié)論：構(gòu)建HGB1的交融表達(dá)載體，得到分散純化交融卵白His-HGB1，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)成效奠基了基矗關(guān)鍵詞高遷徙率族卵白1；原核表達(dá)載體；純化useHGB1PrkarytiExpressinandPurifiatinKeyrdsHighbilitygrupbx1;Prkarytiexpressinvetr;Purifiatin高遷徙率族卵白B1(Highbilitygrupbx1，HGB1)是普及存在于真核細(xì)胞內(nèi)的高度守舊的非組卵白染色體卵白，根本組全長648bp編碼215個氨基酸殘基。已有研究

3、表白，HGB1可由巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞等自動排泄，或由壞死細(xì)胞被動開釋，從而作為一種炎癥晚期因子到場膿毒癥等病理歷程，。研究還創(chuàng)造經(jīng)脂多糖LPS刺激巨噬細(xì)胞后HGB1的排泄量較未刺激顯著增多，而且在8h12h達(dá)峰值。而HGB1發(fā)揮作用的機(jī)制還不是很明晰。因此，分散純化HGB1卵白將對進(jìn)一步研究HGB1的生物學(xué)成效、與其他細(xì)胞因子的彼此作用干系等有緊張意義。本實行以小鼠巨噬細(xì)胞RA264.7為研究工具，經(jīng)LPS刺激后12h提取細(xì)胞總RNA，接納RT-PR擴(kuò)增出含HGB1的目的序列，構(gòu)建pD-19T-HGB1重組載體,亞克隆至高效表達(dá)載體pET-26b(+)，誘導(dǎo)表達(dá)并分散純化含His-標(biāo)簽肽的HG

4、B1交融卵白。1質(zhì)料和要領(lǐng)1.2要領(lǐng)2效果2.2重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建與斷定將HGB1的PR產(chǎn)物克隆于載體pD-19T，以BaH和Xh酶切pD-19T-HGB1，接納目的片斷，并將其亞克隆至經(jīng)同樣酶切的含pel引導(dǎo)肽及His-標(biāo)簽肽的原核表達(dá)載體pET-26b(+)，經(jīng)酶切斷定及序列闡發(fā)證明已樂成構(gòu)建交融表達(dá)載體pET-26b(+)-HGB1。見圖2。2.3重組卵白表達(dá)與純化重組原核表達(dá)載體pET-26b(+)-HGB1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3，37IPTG誘導(dǎo)4h，裂解細(xì)胞，將裂解液離心后分出上清與沉淀，經(jīng)SDS闡創(chuàng)造白誘導(dǎo)產(chǎn)物重要以可溶性情勢存在于上清液后。將含可溶性重組卵白的上清液用N

5、i-NTA柱分散純化，網(wǎng)絡(luò)穿透液及各濃度的咪唑洗脫液，可見隨著咪唑緩沖液濃度增長及洗脫次數(shù)增長，洗脫液中雜卵白漸漸淘汰，至300咪唑洗脫液中得到較高純度的目的卵白HGB1。見圖3。3討論高遷徙率族卵白B1(Highbilitygrupbx1HGB1)固然普及存在于真核細(xì)胞內(nèi)，但是差異的構(gòu)造細(xì)胞，乃至雷同構(gòu)造細(xì)胞在差異生理狀態(tài)下的表達(dá)環(huán)境并不同等。體外實行不雅察到，LPS可引起人類外周血單核細(xì)胞及LPS敏感型小鼠巨噬細(xì)胞HGB1的表達(dá)和開釋5、6。為得到大量HGB1模板，我們用100ng/LLPS刺激體外造就的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系RA264.7，12h后勞績細(xì)胞抽提總RNA，RT-PR效果表現(xiàn)得到

6、了富足量的目的片斷。RA264.7細(xì)胞是被普及用于體外巨噬細(xì)胞系，擔(dān)當(dāng)LPS刺激后RA264.7細(xì)胞能表達(dá)和開釋包羅HGB1在內(nèi)的多種細(xì)胞因子。以它為研究工具的HGB1基因克壟原核表達(dá)和純化的實行有輕便和易于操縱等長處。為了使目的卵白在原核細(xì)胞中排泄型表達(dá)，淘汰原核表達(dá)的卵白產(chǎn)物在細(xì)胞漿中過分聚攏形成包容體而導(dǎo)致生物學(xué)活性落落的大概，本實行選用pET-26b(+)質(zhì)粒作為目的卵白重組載體，這一載體在多克隆位點卑劣含有pelB信號肽，可以引導(dǎo)表達(dá)的卵白進(jìn)入細(xì)胞周間質(zhì)，信號肽即被卵白酶水解，而產(chǎn)生越發(fā)不變的游離表達(dá)產(chǎn)物。由于表達(dá)的卵白可以在細(xì)胞周間質(zhì)舉行折疊，大概具有自然卵白的構(gòu)象，以是生物學(xué)活性

7、較好。別的，pET-26b(+)質(zhì)粒載體中含有由六個組氨酸構(gòu)成的His-標(biāo)簽，與目的卵白交融表達(dá)后便于通過Ni2+親和層析柱舉行分散純化，而6His標(biāo)簽一樣平常不影響卵白質(zhì)的排泄或折疊，因此不會滋擾卵白的布局與成效，無須在純化之后將其從卵白上去除，。本研究樂成構(gòu)建了HGB1原核表達(dá)載體，而且得到純化的含His-標(biāo)簽肽的交融卵白，為以后進(jìn)一步研究其生物學(xué)成效奠基基矗參考文獻(xiàn)ullerS,RnfaniL,BianhiE.RegulatedexpressinandsubellularlalizatinfHGB1,ahratinprteinithaytkinefuntin.JurnalfInterna

8、lediine,2022,255：332343.GardellaS,Andrei,FerreraD,etal.ThenulearprteinHGB1isseretedbynytesviaann-lassial,vesile-ediatedseretrypathay.EBRep,2002,3：9951001.DbeliH,TreziakA,GillessenD,etal.Expressin,purifiatin,biheialharaterizatinandinhibitinfrebinantplasdiufaliparualdlase.lBiheParasitl,1990,41：259268LindnerP,GutllB,ulfing,etal.Purifiatinfnativeprte