基因工程第二章載體

1、基因工程第二章載體第1頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二第二章 基因克隆的載體引 言（introduction）第一節(jié) 質(zhì)粒載體（plasmid vectors）第二節(jié) 噬菌體載體（phage vectors）第2頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二質(zhì)粒載體的生物學(xué)特征（1）質(zhì)粒是一種廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的能自主的復(fù)制的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡(jiǎn)單。在霉菌、藍(lán)藻、酵母和一些動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對(duì)細(xì)菌的質(zhì)粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質(zhì)粒。（2）質(zhì)粒的大小差異很大，最小的只有1kb,只能編碼中等大小的2-3種蛋白質(zhì)分子，

2、最大的達(dá)到200kb。質(zhì)粒的拷貝數(shù)多則50，少則只有一個(gè)。第3頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二（3）質(zhì)粒的不親和性，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存，屬于同一個(gè)不親和群，如pMB1或ColE1的派生質(zhì)粒。已鑒別出25個(gè)以上大腸桿菌質(zhì)粒的不親和群，它們是不相容群體的。（4）質(zhì)粒的分類 F質(zhì)粒，或叫致育質(zhì)粒，僅攜帶轉(zhuǎn)移基因，特征：促進(jìn)質(zhì)粒間的有性結(jié)合。 R質(zhì)粒，或叫耐藥性質(zhì)粒，能賦予宿主細(xì)胞耐藥性，特征：耐藥性。 Ti質(zhì)粒,根瘤農(nóng)桿菌中的毒性質(zhì)粒，賦予宿主細(xì)胞致病性。 Col 質(zhì)粒， 降解質(zhì)粒，質(zhì)粒載體的生物學(xué)特征第4頁，共22頁，2022年，5月20

3、日，12點(diǎn)7分，星期二（5）質(zhì)粒的存在形式 有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種。在瓊脂糖凝膠電泳中，不同構(gòu)型的同一種質(zhì)粒DNA，盡管分子量相同，仍具有不同的電泳遷移率。其中走在最前面的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋SC構(gòu)型）開環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口， OC構(gòu)型）線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口，L構(gòu)型）質(zhì)粒載體的生物學(xué)特征第5頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二（1）pUC是在pBR322基礎(chǔ)上發(fā)展起來的克隆載體。大小為2.7 kb，帶有復(fù)制起始位點(diǎn)，ampicillin 抗性基因和lacZ 基因。常用質(zhì)粒載體介紹第6頁，共22頁，2022年

4、，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二（2）pGEM-3Z 帶有 LacZ 基因，大小為2.9 kb ，氨芐青霉素抗性基因，高拷貝。第7頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二（3）pBluescript SK pBluescript SK 同 pGEM 類似，另外還帶有線狀噬菌體f1 的復(fù)制起始位點(diǎn)。 可以產(chǎn)生單鏈DNA。第8頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二第二章 基因克隆的載體引 言（introduction）第一節(jié) 質(zhì)粒載體（plasimid vectors）第二節(jié) 噬菌體載體（phage vectors）第9頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)

5、7分，星期二第二節(jié) 噬菌體載體一、噬菌體 1 噬菌體的生物學(xué)特征 2 噬菌體的侵染 3 噬菌體的DNA分子二、M13噬菌體第10頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 噬菌體的生物學(xué)特性 噬菌體由正二十面體的蛋白質(zhì)頭部和中空管狀的蛋白質(zhì)尾部組成。頭部包含線狀染色體DNA，侵染寄主時(shí)將自己的DNA注入寄主細(xì)菌。 噬菌體屬溫和噬菌體。第11頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二噬菌體的生物學(xué)特性The Phage consist of a linear chromosome enclosed in a protein coat (capsid,衣殼 ). Whe

6、n the phage infecting the host cells, it injects its DNA into the host bacterium. 第12頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 噬菌體的侵染 噬菌體的侵染是溶源侵染，是噬菌體DNA分子在宿主細(xì)胞中能夠穩(wěn)定存在，許多噬菌體DNA能整合到寄主細(xì)胞染色體上并可以隨著寄主細(xì)胞的分裂而進(jìn)行復(fù)制。 在溶源性細(xì)菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體DNA被稱為原噬菌體（prophage ）。而攜帶了原噬菌體的細(xì)菌被稱為溶源菌（lysogen ） 。第13頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 噬菌體

7、的侵染第14頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二噬菌體的侵染過程Lysogenic cycle (溶源周期)：Under certain circumstances, however, the lambda DNA inserts itself into the E. coli chromosome and is a stable part of the chromosome. The Lambda DNA is replicated along Withthe E.coli chromosome. If the host cell becomes damaged, suc

8、h as UV treatment, the prophage DNA excises itself and undergoes lytic growth.第15頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二噬菌體的DNA分子 DNA的分子為49kb, 大多數(shù)基因已經(jīng)測(cè)序和定位。至少包括61個(gè)基因，其中一部分為噬菌體生命活動(dòng)的必須基因，另一部分（b2區(qū)）可以被外源基因取代而不會(huì)影響到噬菌體的正常功能。第16頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二噬菌體的DNA分子 DNA在分子兩端各有12個(gè)堿基的單鏈互補(bǔ)粘性末端。當(dāng)其注入到寄主細(xì)胞中后，可以迅速通過這兩個(gè)粘性末端的互

9、補(bǔ)作用形成雙鏈的環(huán)形DNA分子。上述通過粘性末端互補(bǔ)形成的雙鏈區(qū)被稱為cos位點(diǎn)（cohesive end site）.另外的作用是內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列。 第17頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二第二節(jié) 噬菌體載體一、噬菌體二、M13噬菌體 1 M13噬菌體的生物學(xué)特征 2 M13噬菌體的侵染 3 M13噬菌體的載體第18頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二1. M13噬菌體的生物學(xué)特性 M13是線狀的大腸桿菌噬菌體，顆粒內(nèi)含有6 047bp的閉合環(huán)狀單鏈DNA基因組，相對(duì)小，意味著可供插入的外源DNA 的空間小。 M13單鏈DNA的復(fù)制型（RF，re

10、plicative form）是呈雙鏈環(huán)形，此時(shí)的DNA，不會(huì)插入細(xì)菌基因組，持續(xù)復(fù)制，當(dāng)積累到100-200個(gè)拷貝后，噬菌體DNA編碼的正鏈特異結(jié)合蛋白很快就阻止了負(fù)鏈的進(jìn)一步生成，但以負(fù)鏈為模板的正鏈合成并未受到影響。大量游離的正鏈DNA很快參入到外殼蛋白中形成了大量新的噬菌體顆粒。第19頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二M13噬菌體的侵染第20頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二作為載體的優(yōu)勢(shì)1 基因組小于10 kb, 適合載體的要求。2 復(fù)制時(shí)其雙鏈形式，可以像對(duì)質(zhì)粒一樣處理。3 容易培養(yǎng)或轉(zhuǎn)染，容易獲得基因組。4 突出優(yōu)點(diǎn)在于可以提供單鏈DNA，這在DNA 測(cè)序和體外突變中作用明顯。4 在M13基因組中有一段507bp的基因間隔區(qū)，該區(qū)可以接受外源DNA的插入而不會(huì)影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體能用于載體的重要