生物技術(shù)制藥

1、一、概述1、生物藥物生物藥物是指運用生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)等的研究成果，從生物體、生物組織、細(xì)胞、體液等，綜合利 用物理學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、生物技術(shù)和藥學(xué)等學(xué)科的原理和方法制造的一類用于預(yù)防、治療和診斷的制 品。2、生物技術(shù)制藥采用現(xiàn)代生物技術(shù)人為地創(chuàng)造一些條件，借助某些微生物、植物或動物來生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品。3、生物技術(shù)藥物采用DNA重組技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)或其它生物新技術(shù)研制的蛋白質(zhì)、治療性抗體或核酸類藥物。4、生物技術(shù)以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體或生物組織、細(xì)胞及其組分的特性和功能，設(shè)計構(gòu)建具有預(yù)期性狀的 新物種或新品系，并與工程相結(jié)合，利用這樣的新物種品系進(jìn)行加工生產(chǎn)，為社會提供商品和服

2、務(wù)的 一個綜合性技術(shù)體系。5、生物技術(shù)的內(nèi)容基因、細(xì)胞、酶、發(fā)酵、生化、蛋白質(zhì)、抗體、糖鏈工程和海洋生物技術(shù)。6、生物技術(shù)的相關(guān)學(xué)科生物學(xué)微生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)化學(xué)生物化學(xué)、無機(jī)、有機(jī)、分析、物理化學(xué)工程學(xué)化學(xué)工程、電子工程醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、農(nóng)學(xué)。7、生物技術(shù)的應(yīng)用1、醫(yī)藥利用基因治療人類疾病的技術(shù)取得了突破性進(jìn)展，原來用于治療單基因缺陷的遺傳病的治療技術(shù)，現(xiàn)在已快速擴(kuò)展到癌癥、愛滋病、乙型肝炎、心血管病，此外，診斷試劑、酶試劑、動植物醫(yī)藥產(chǎn)品、 核酸類藥物也取得了很大進(jìn)展。2、農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因動植物的新品種，大幅度提高產(chǎn)量和質(zhì)量。3、食品氨基酸天冬氨酸、半胱氨酸，有機(jī)酸蘋果酸、酒石酸，做食品添加劑

3、，香料，葡萄糖，果糖，淀粉酶。4、工業(yè)農(nóng)藥、香料、飼料、工業(yè)酶、有機(jī)酶、皮革工業(yè)脫毛軟化、絲綢脫膠、加酶洗衣粉。5、環(huán)境凈化利用微生物或酶處理廢物和廢水。6、能源微生物發(fā)酵產(chǎn)甲烷一沼氣。二、生物技術(shù)發(fā)展簡史生物技術(shù)是人類對生物資源微生物、動植物的利用、改造并為人類服務(wù)的技術(shù)，它的發(fā)展已有幾千年的歷史，將其發(fā)展過程按技術(shù)特征可分為三個階段。1、傳統(tǒng)生物技術(shù)階段出現(xiàn)在公元前幾千年，直到 20世紀(jì)30年代，主要是釀造技術(shù)，當(dāng)時人們只知道釀 造技術(shù)，但不知道這些技術(shù)的內(nèi)在原因，1680年出現(xiàn)了顯微鏡，人們才知道有微生物的存在，1857年用實驗方法證明了酒精發(fā)酵與酵母菌有關(guān)，并最終確征為酶，到此才揭開了

4、發(fā)酵現(xiàn)象的奧秘。該階段的產(chǎn)品：乳酸、酒精、丙酮、丁醇、檸檬酸、淀粉酶。該階段生產(chǎn)的特點：過程簡單，大多數(shù)屬于兼氣發(fā)酵或外表培養(yǎng)，生產(chǎn)設(shè)備要求不高，產(chǎn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單，屬于初級代謝產(chǎn)物。2、近代生物技術(shù)階段 20世紀(jì)40年代，第二次世界大戰(zhàn)的爆發(fā)，急需療效好、毒副作用小的抗細(xì)菌感染藥物，出現(xiàn)了青霉素，產(chǎn)量低，產(chǎn)品價格昂貴，隨著發(fā)酵新技術(shù)的出現(xiàn)，又相繼發(fā)現(xiàn)了鏈霉素、紅霉素、金霉素等藥物。 該階段的主要產(chǎn)品：抗生素、維生素、管體、氨基酸；食品工業(yè)的工業(yè)酶制劑、食用氨基酸、酵母、啤酒；化工業(yè)的酒精、丙酮、丁醇、沼氣；農(nóng)林業(yè)的農(nóng)藥；環(huán)境保護(hù)業(yè)的生物治理污染。該階段生物技術(shù)的特點：1、產(chǎn)品類型多，初級氨基酸

5、、酶、有機(jī)酸；次級抗生素；生物轉(zhuǎn)化管體。2、生物技術(shù)要求高，純種、無菌、通氣、產(chǎn)品質(zhì)量要求也高。3、生產(chǎn)設(shè)備規(guī)模大，500立方米，2000立方米。4、技術(shù)發(fā)展速度快，青霉素，200單位每毫升，8萬單位每毫升，形成了交叉學(xué)科生化工程。3、現(xiàn)代生物技術(shù)標(biāo)志，1953年美國Watson和英國的Crick共同提出了 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，揭開了生命科學(xué)劃時代的一頁，此后，又相繼出現(xiàn)了一系列新發(fā)現(xiàn)和新進(jìn)展，遺傳中心法則，破譯遺傳密碼，基因重組，單克隆抗體，DNA測序。產(chǎn)品見表1-1。動植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。該階段產(chǎn)品種類很多，胰島素、干擾素、生長激素等。動植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。該階段產(chǎn)品種類很多，胰島素、干擾素、

6、生長激素等。該階段生物技術(shù)的內(nèi)容包括：1、重組DNA技術(shù)及其它轉(zhuǎn)基因技術(shù)；2、細(xì)胞和原生質(zhì)體融合技術(shù)；3、酶或細(xì)胞的固定化技術(shù)；4、植物脫毒和快速繁殖技術(shù)；5、動物細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)；6、動物胚胎工程技術(shù)；三、醫(yī)藥生物技術(shù)新進(jìn)展7、現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)高密度發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、新型發(fā)酵技術(shù)；8、現(xiàn)代生物反應(yīng)工程和別離工程技術(shù)；9、蛋白質(zhì)工程技術(shù)；10、海洋生物技術(shù)。近10年是生物技術(shù)迅速發(fā)展的時期，主要有四個方面的進(jìn)展。1、基礎(chǔ)研究不斷深入重組DNA,新基因的克隆和基因表達(dá)調(diào)控的研究全面展開，分子生物學(xué)理論和技術(shù)兩大體系已基本完成， 生物學(xué)中的中心法則所表達(dá)的遺傳信息的轉(zhuǎn)移規(guī)律奠定了遺傳工程的理論基礎(chǔ)，有關(guān)

7、基因表達(dá)的各種研究 結(jié)果又豐富和發(fā)展了中心法則， DNA測序，為對付不治之癥提供了可能性。人類基因組計劃的研究目標(biāo)就是要定位所有的基因和測定它們的核甘酸序列，人類基因組大約有10萬個基因，30億個核甘酸對，完成這項研究是一項空前浩大的工程，它的實施對人類了解自身和醫(yī)學(xué)發(fā)展有劃時 代的意義。與疾病相關(guān)的基因有約5000個，一些重要的遺傳病基因已被別離并測序。3、新產(chǎn)品不斷出現(xiàn)自20世紀(jì)80年代以來，僅美國、日本開發(fā)的生物新技術(shù)新藥物便達(dá)200多種，大都是重組蛋白質(zhì)藥物和重組DNA藥物。世界范圍內(nèi)，銷路最好的生物技術(shù)藥物，臨床應(yīng)用時間比較長，療效比較好，毒副作用比較小，干擾素， 抗病毒、抗癌，有種

8、屬特異性，動物干擾素對人無效，最初收集大量血液，提取白血球再與誘導(dǎo)物作用來 生產(chǎn)，現(xiàn)在用基因重組技術(shù)把干擾素基因插入大腸桿菌來生產(chǎn)。白介素與機(jī)體免疫功能有關(guān)，白介素-2促進(jìn)淋巴細(xì)胞分化增殖。乙型肝炎疫苗，預(yù)防乙肝。集落刺激因子，可減輕化療時副作用，可用于愛滋病、 白血病。腫瘤壞死因子，可損傷癌細(xì)胞。研制更新一代的藥物和更新的應(yīng)用方法，集落刺激因子和白介素 的基因構(gòu)建到酵母細(xì)胞中，使之產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)，藥效增強(qiáng)。生產(chǎn)方法從利用重組DNA的微生物生產(chǎn)轉(zhuǎn)向利用動植物來生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物，構(gòu)建新型多價活疫苗。3、新試劑、新技術(shù)不斷出現(xiàn)細(xì)胞工程及基因工程的應(yīng)用產(chǎn)生了新的醫(yī)療技術(shù)一細(xì)胞移植和基因治療。細(xì)胞移植

9、用于骨髓移植，治療白 血病、淋巴病，免疫缺陷，再生障礙性貧血及放療、化療后的腫瘤病人，基因治療目前仍在實驗階段，可 用于遺傳病、癌癥、愛滋病的治療，心臟內(nèi)直接注入外來基因，兩三周長出新血管，關(guān)鍵點是如何將有用 基因引入靶組織中，并使之在合適的地方、合適的時間表達(dá)合適量的活性多肽或蛋白質(zhì)。生物試劑的開發(fā)，單克隆抗體，專一性強(qiáng)，由鼠源性轉(zhuǎn)向人源性，應(yīng)用：基礎(chǔ)研究，診斷，體內(nèi)顯像定位， 食品和環(huán)境檢測，體內(nèi)治療和導(dǎo)向治療。工業(yè)上利用單抗進(jìn)行親和層析高效純化天然基因工程基因，單抗 可與放射性核素、酶、熒光素標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，用于檢測和治療。病毒、細(xì)菌、寄生蟲和某些腫瘤的診斷， 免疫學(xué)，激素、酶和環(huán)境污染

10、因子的檢測，顯像定位，單抗與抗癌藥物偶合后，減少副作用，加大藥量。4、新型生物反應(yīng)器和新別離技術(shù)不斷出現(xiàn)傳統(tǒng)：攪拌式生物反應(yīng)器改進(jìn)：塑料袋、填充床、氣升式、流化床、固定床、袋式、膜式、中空纖維、固定化培養(yǎng)。攪拌形狀改進(jìn)：漿式、棒式、船帆式、籠式通氣。1000升。四、我國的醫(yī)藥生物技術(shù)我國起步晚，20世紀(jì)80年代初，把生物技術(shù)定為科技和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要新領(lǐng)域之一，85年制定了生物技術(shù)發(fā)展政策，89年制定了 90-2000年和2020年發(fā)展綱要。20世紀(jì)70年代，起步時是固定化酶的研究，固定化細(xì)胞， 80年代初期，開發(fā)研究乙型肝炎基因工程疫苗， 基因工程干擾素，國內(nèi)投入大量資金建立30個生物技術(shù)領(lǐng)域

11、國家重點實驗室，可生產(chǎn)活性多肽類藥物、干擾素、白介素、心鈉素等多種生物藥物。五、醫(yī)藥生物技術(shù)發(fā)展展望20世紀(jì)生物技術(shù)是科研階段，產(chǎn)業(yè)初期。21世紀(jì)將進(jìn)入大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化，研究成果轉(zhuǎn)變成產(chǎn)品。三大類藥物：生物、化學(xué)、中藥。發(fā)展比較迅速的醫(yī)藥生物技術(shù)有四個領(lǐng)域：1、利用新發(fā)現(xiàn)的人類基因，開發(fā)新型藥劑完成人類基因組計劃會發(fā)現(xiàn)許多新基因，而且很多與疾病有關(guān)或直接參與疾病的形成，找到了目的基因一也就是需要修復(fù)的基因可以幫助我們利用基因工程來尋找新藥或基因治療的方法，21世紀(jì)50%-70%的新藥來自基因工程的研究。2、新型疫苗的研制疫苗在許多疾病的預(yù)防、治療中起著其他藥物無法代替的作用，現(xiàn)在正在進(jìn)行愛滋病及2

12、0多種基因型癌癥疫苗的研制，用于防治癌癥、愛滋病、關(guān)節(jié)炎、貧血、骨質(zhì)疏松、百日咳、乙肝等疾病。3、基因工程活性肽淋巴因子，生長因子，激素，酶，都屬于活性多肽。由兩條以上肽鏈組成，很強(qiáng)的生物活性，常以微量存在于人體基因工程方法生產(chǎn)應(yīng)用：1在體外和離體研究中作為細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充劑2基礎(chǔ)研究對象3作為研究其他現(xiàn)象免疫的一種輔助劑4診斷劑5生物治療的研究開發(fā) 腦啡肽、胃腸肽。4、其他疾病早期診斷，PCR單克隆抗體 轉(zhuǎn)基因材料 外源基因在植物中表達(dá)，腦啡肽，干擾素，生長激素，轉(zhuǎn)血 紅蛋白基因的煙草植物生產(chǎn)人造血漿。一、生物藥物的來源1、生物藥物的定義生物藥物是指運用生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)等的研究成果，從生物

13、體、生物組織、細(xì)胞、體液等，綜合利 用物理學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、生物技術(shù)和藥學(xué)等學(xué)科的原理和方法制造的一類用于預(yù)防、治療和診斷的制 品。2、生物藥物的原料來源天然的生物材料：人體、動植物、微生物和各種海洋生物。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，有目的人工制得的生物原料成為當(dāng)前生物制藥原料的重要來源，如用基因工程技術(shù)制得的微生物或細(xì)胞。生物藥物原料的選擇、預(yù)處理與保存方法。1、原料選擇原則 有效成分含量高，原料新鮮，來源豐富、易得，產(chǎn)地較近，原料中雜質(zhì)含量少，成本 低。2、預(yù)處理與保存 預(yù)處理：就地采集后去除結(jié)締組織、脂肪組織等不用的成分，將有用成分保鮮處 理，收集微生物原料時，要及時將菌體與培養(yǎng)液分開，進(jìn)行保

14、鮮處理。保存方法：冷凍法，適用于所有生物原料，-40 C;有機(jī)溶劑脫水法，丙酮，適用于原料少、價值高，有機(jī)溶劑對原料生物活性無影響；防腐劑保鮮，常用乙醇、苯酚等，適用于液體原料，如發(fā)酵液、提取液。二、生物藥物的特性1、藥理學(xué)特性1、治療的針對性強(qiáng) 細(xì)胞色素c用于治療組織缺氧所引起的一系列疾病。2、藥理活性高 注射用的純ATP可以直接供給機(jī)體能量。3、毒副作用小、營養(yǎng)價值高蛋白質(zhì)、核酸、糖類、脂類等生物藥物本身就直接取自體內(nèi)。4、生理副作用時有發(fā)生 生物體之間的種屬差異或同種生物體之間的個體差異都很大，所以用藥時會發(fā)生免疫反應(yīng)和過敏反應(yīng)。2、生產(chǎn)、制備中的特殊性1、原料中的有效物質(zhì)含量低激素、酶

15、在體內(nèi)含量極低。2、穩(wěn)定性差 生物藥物的分子結(jié)構(gòu)中具有特定的活性部位，該部位有嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)，一旦結(jié)構(gòu)破壞，生物活性也就隨著消失。酶，很多理化因素使其失活。3、易腐敗 生物藥物營養(yǎng)價值高，易染菌、腐敗。生產(chǎn)過程中應(yīng)低溫、無菌。4、注射用藥有特殊要求 生物藥物易被腸道中的酶所分解所以多采用注射給藥，注射藥比口服藥要求更 嚴(yán)格，均一性、安全性、穩(wěn)定性、有效性。理化性質(zhì)、檢驗方法、劑型、劑量、處方、儲存方式。3、檢驗上的特殊性由于生物藥物具有生理功能，因此生物藥物不僅要有理化檢驗指標(biāo)，更要有生物活性檢驗指標(biāo)。第一節(jié)概述生物技術(shù)的核心是基因工程，基因工程技術(shù)最成功的成就是用于生物治療的新型生物藥物的研

16、制。之前， 許多在疾病診斷、治療和預(yù)防中有重要價值的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)激素、細(xì)胞因子、神經(jīng)多肽、調(diào)節(jié)蛋 白、酶類、凝血因子等以及某些疫苗，由于材料來源困難或制造技術(shù)問題而無法研制出產(chǎn)品，即使應(yīng)用 傳統(tǒng)技術(shù)從動物器官中提取出來，也因為造價太高而使患者負(fù)擔(dān)不起。而應(yīng)用基因工程技術(shù)就可以從根本 上解決上述問題，它的應(yīng)用使人們在解決癌癥、心血管疾病和內(nèi)分泌疾病等方面中取得明顯效果，它為上 述疾病的預(yù)防、治療和診斷提供了新型疫苗、新型藥物和新型診斷試劑。利用基因工程生產(chǎn)的藥物主要是醫(yī)用活性蛋白和多肽：免疫性蛋白，各種抗原和單克隆抗體；細(xì)胞因子， 干擾素、白介素、生長因子；激素，胰島素、生長激素；酶類，尿

17、激酶、鏈激酶超氧化物歧化酶。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥物的優(yōu)點：1、大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽，為臨床使用提供有效的保障；2、可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍；3、可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；4、內(nèi)源生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時存在的不足之處，可通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除；5、可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源。第二節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程基因工程技術(shù)就是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌，實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)?；?/p>

18、因工程藥物制造的主要程序是：目的基因的克?。粯?gòu)建DNA重組體；將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌；工程菌的發(fā)酵；外源基因表達(dá)產(chǎn)物的別離純化；產(chǎn)品的檢驗等。通常將基因工程藥物的生產(chǎn)分為上游和下游技術(shù)。上游階段是研究開發(fā)必不可少的基礎(chǔ)，它主要是別離目 的基因，構(gòu)建工程菌，主要在實驗室完成。下游階段是從工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)到產(chǎn)品的別離純化、質(zhì)量控 制，該階段是將實驗室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化。制備基因工程藥物的一般程序：獲得目的基因 組建重組質(zhì)粒 構(gòu)建基因工程菌培養(yǎng)工程菌 產(chǎn)物別離純化 除菌過濾 半成品檢定 成品檢定 包裝基因的表達(dá)系統(tǒng)有原核生物系統(tǒng)和真核生物生物系統(tǒng)。選擇表達(dá)系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)的蛋白

19、質(zhì)的功 能，其次是表達(dá)量的多少和別離純化的難易。下游下工技術(shù)主要包括工程菌大規(guī)模培養(yǎng)最正確參數(shù)確實定、新型生物反應(yīng)器的研制、高效別離介質(zhì)及裝 置的開發(fā)、別離純化的優(yōu)化控制、高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)、生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計和制造、 電子電腦的優(yōu)化控制等。第三節(jié)目的基因的獲得對于原核生物，其基因總量不大，可以選用合適的限制性核酸內(nèi)切酶切下目的基因，而對于真核生物不能 進(jìn)行直接別離。真核細(xì)胞中基因總量較大，從染色體中直接別離純化目的基因極為困難，另外，真核基因 一般都有內(nèi)含子，如果以原核細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，即使別離出真核基因，由于原核細(xì)胞缺乏mRNA轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)，真核基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA也不

20、能被加工、拼接成為成熟的 mRNA ,因此不能直接克隆真核基因。 克隆真核基因常用的方法有逆轉(zhuǎn)錄法和和學(xué)合成法。一、逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法就是先別離純化目的基因的mRNA,再反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ) DNA,然后進(jìn)行互補(bǔ) DNA的克隆表達(dá)。從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取mRNA,以其為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白質(zhì) mRNA的互補(bǔ)DNA,再以互補(bǔ)DNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶或 DNA聚合酶作用下，最終合成編碼該蛋白質(zhì)的雙鏈DNA序列，該序列不含內(nèi)含子。1、mRNA的純化細(xì)胞內(nèi)含有三種 RNA, mRNA占RNA總量的2%-5%,相對分子量大小不一致，別離也有很大的困難，但是 mRNA的3末端常含有一多

21、聚腺甘酸組成的末端，長達(dá) 20-250個腺甘酸，足以吸W于寡聚胸甘酸名千維素上，從而可以用親和層析法將mRNA從細(xì)胞總RNA上另I離出來，可得到純度較高的mRNA。2、互補(bǔ)DNA第一鏈的合成mRNA的3末端常含有一多聚腺甘酸序列，可用寡聚脫氧胸甘酸為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始互補(bǔ)DNA的合成。在合成反應(yīng)體系中加入一種放射性標(biāo)記的dNTP,在反應(yīng)中以及反應(yīng)后可通過測定放射性標(biāo)記的dNTP摻入量，計算出互補(bǔ) DNA的合成效率，在凝膠電泳后，進(jìn)行放射自顯影分析產(chǎn)物的分子大小，探 索最正確反應(yīng)條件。3、互補(bǔ)DNA第二條鏈的合成先用堿解或核酸酶酶解的方法除去互補(bǔ)DNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈，

22、然后以互補(bǔ)DNA第一鏈為模板合成第二鏈，并用核酸酶 S1專一性切除單鏈DNA。4、互補(bǔ)DNA克隆載體有兩種質(zhì)粒和噬菌體，根據(jù)重組后插入的互補(bǔ) DNA是否能夠表達(dá)、能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)，又 將載體分為表達(dá)型載體和非表達(dá)型載體?；パa(bǔ)DNA插入片段小于10千堿基對，可選用質(zhì)粒載體，如大于10千堿基對則選用噬菌體作為載體。二、化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以采用人工化學(xué)合成法合成，其先決條件是已知目的基因的核甘酸序列，或已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，按相應(yīng)的密碼子推導(dǎo)出DNA的堿基序列。用化學(xué)方法合成目的基因不同部位的兩條鏈的寡核甘酸短片段，再退火成為兩端形成粘末端的DNA雙鏈片段，然后將這

23、些雙鏈片段按正確的次序進(jìn)行退火使連接成較長的 DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。人工化學(xué)合成的限制：1、不能合成太長的基因，50-60個堿基對；2、人工合成堿基對時，遺傳密碼的簡并會為選擇密碼子帶來很大的困難；3、費用較高。第四節(jié)基因表達(dá)基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。進(jìn)行基因表達(dá)，我們所關(guān)心的是目的 基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，產(chǎn)物的生物學(xué)活性和表達(dá)產(chǎn)物的別離純化。一、宿主細(xì)胞的選擇宿主細(xì)胞應(yīng)滿足以下要求：1、容易獲得較高濃度的細(xì)胞；2、能利用廉價易得的原料；3、不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；4、發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；5、容易進(jìn)行代謝調(diào)控

24、；6、容易進(jìn)行 DNA重組技術(shù)操作；7、產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取。宿主細(xì)胞的種類及特點 宿主可分為兩大類： 原核細(xì)胞一大腸桿菌、枯草芽抱桿菌、鏈霉菌； 真核細(xì)胞一酵母菌、絲狀真菌、哺乳動物細(xì)胞。1、原核細(xì)胞1、大腸桿菌生長迅速、對其研究比較深入，所以常用，特點：表達(dá)基因工程產(chǎn)物的形式多種多樣，有細(xì)胞內(nèi)不溶性表 達(dá)包含體、胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)等，極少數(shù)還可以分泌到細(xì)胞外表達(dá)。限制：沒有信號肽，所以產(chǎn)品多為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，提取時需破碎細(xì)胞，這樣細(xì)胞質(zhì)內(nèi)其他蛋白質(zhì)也釋放出來， 造成提取困難，由于分泌力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表達(dá)產(chǎn)物必須在下游處理過程中經(jīng) 過變性和復(fù)性處理才

25、能恢復(fù)其生物活性。2、枯草芽抱桿菌分泌能力強(qiáng)可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包含體，但該菌也不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化，另 外由于它有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，會對產(chǎn)物進(jìn)行降解。3、鏈霉菌主要特點：不致病、使用安全、分泌能力強(qiáng)、可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力。2、真核細(xì)胞1、酵母特點：是研究基因表達(dá)調(diào)控最有效的單細(xì)胞真核微生物，基因組小，僅為大腸桿菌的4倍，世代時間短，有單倍體、雙倍體兩種形式。繁殖迅速、可以廉價地大規(guī)模培養(yǎng)，沒有毒性。能將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到胞 外，表達(dá)產(chǎn)物能糖基化。2、絲狀真菌特點：有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力，能正確進(jìn)行翻譯后加工，而且糖基化方式與高等真核生物相似。

26、3、哺乳動物細(xì)胞特點：產(chǎn)物可分泌到胞外，細(xì)胞培養(yǎng)液成分完全可控制，使產(chǎn)物純化較容易，表達(dá)產(chǎn)物能糖基化，接近或 類似與天然產(chǎn)物；動物細(xì)胞生產(chǎn)慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度較稀。綜上所述，目前使用最廣泛的宿主仍然是大腸桿菌和釀酒酵母。因為對它們的遺傳背景研究得比較清楚， 建立了許多適合于它彳門的克隆載體和DNA導(dǎo)入方式，并且許多外源在這兩種宿主菌中得到表達(dá)成功。二、大腸桿菌中的基因表達(dá)1、載體根據(jù)真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的特點，表達(dá)載體應(yīng)具備以下條件：1、載體能夠獨立復(fù)制，有復(fù)制起點，有嚴(yán)緊型和松弛型，嚴(yán)緊型伴隨宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制，在宿主細(xì)胞中拷貝少1-3；松弛型的復(fù)制可不依賴

27、與宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中拷貝多達(dá)3000個。2、應(yīng)有靈活的克隆位點和方便的篩選標(biāo)記，利于外源基因的克隆、鑒定和篩選。3、應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動子，能為達(dá)成桿菌的RNA聚合酶所識別。4、應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。5、應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使 RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無關(guān)的基因，同時很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。6、所產(chǎn)生的mRNA必須有翻譯的其始信號。2、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素外源基因在宿主中的表達(dá)受許多因素影響的，所以在建立表達(dá)體系時要綜合考慮各種因素的作用，建立一 個合適的表達(dá)體系，從而使外源基因得到最大的表達(dá)量，獲

28、得最多的表達(dá)產(chǎn)物。1、外源基因的拷貝數(shù)外源基因是克隆到載體上的，所以載體在宿主中的拷貝數(shù)就直接與外源基因的表達(dá)相關(guān)，應(yīng)將外源基因克隆到高拷貝的質(zhì)粒載體上，這對于提高外源基因的總體表達(dá)水平非常有利。2、外源基因的表達(dá)效率啟動子的強(qiáng)度一在轉(zhuǎn)錄水平上直接影響基因的表達(dá)、核糖體結(jié)合位點的有效性、SD序列和起始ATG的間距、密碼子的組成等都會不同程度地影響外源基因的表達(dá)。3、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性表達(dá)的外源基因，其產(chǎn)物會受到宿主細(xì)胞內(nèi)降解該蛋白質(zhì)的酶的作用，使得實際產(chǎn)量很低?？刹捎靡韵路?法來提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白；利用大腸桿菌的信號肽或某些真核多肽中自 身的信號肽，把真核基因產(chǎn)物運

29、輸?shù)桨麧{周質(zhì)的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解；采用位點特異性突 變的方法，改變真核蛋白二硫鍵的位置，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì) 胞。4、細(xì)胞的代謝負(fù)荷外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的大量表達(dá)，必然會影響宿主細(xì)胞正常的生長代謝，有些產(chǎn)物對宿主還會有毒害作 用，將細(xì)胞殺死，為了減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷，同時還得提高外源基因的表達(dá)水平，可以采取當(dāng)宿主細(xì) 胞大量生長時，抑制外源基因的表達(dá)。即將細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)分成兩個階段，使表達(dá)產(chǎn)物不會 影響細(xì)胞的正常生長，當(dāng)宿主細(xì)胞的生物量到達(dá)飽和時，再進(jìn)行基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)合成，以減低宿主細(xì)胞的 代謝負(fù)荷；另外，將宿主細(xì)胞的生長與重組質(zhì)粒

30、的復(fù)制分開，當(dāng)宿主細(xì)胞迅速生長時，抑制重組質(zhì)粒的復(fù) 制，當(dāng)細(xì)胞生長量累積到一定水平后，再誘導(dǎo)細(xì)胞中重組質(zhì)粒的復(fù)制，增加質(zhì)?？截悢?shù)。5、工程菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)條件使外源基因大量表達(dá)。3、真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式三種：融合蛋白、非融合蛋白、分泌型。1、融合蛋白融合蛋白的氨基端是原核序列，竣基端是真核序列，這樣的蛋白質(zhì)是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的。優(yōu)點：基因操作簡便、蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定、不易被細(xì)菌酶類所降解、容易實現(xiàn)高效表達(dá)。缺點：只能做抗原作用，原核多肽序列可能會影響真核蛋白的免疫原性?？稍偾懈畛蓛蓚€多肽鏈。2、非融合蛋白表達(dá)非融合蛋白的操縱子必須改建成：細(xì)菌或噬菌體的啟

31、動子一細(xì)菌的核糖體結(jié)合位點一真核基因的起始 密碼子一結(jié)構(gòu)基因一終止密碼。要求核糖體結(jié)合位點序列與翻譯起始密碼之間的距離要合適，稍有不適就 會影響表達(dá)效率。優(yōu)點：能夠較好地保持原來的蛋白活性；缺點：容易被蛋白酶破壞，氨基末端常常帶有甲硫氨酸，在人體內(nèi)用藥時可能會引起人體免疫反應(yīng)。3、分泌型將外源基因接到信號肽之后，使之在胞質(zhì)內(nèi)有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，當(dāng)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜之間的周質(zhì)后時，被信號肽酶識別切割，從而釋放出有生物活性的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。特點：一些可被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶所降解的蛋白質(zhì)在周質(zhì)中是穩(wěn)定的；由于有些蛋白質(zhì)能按一定的方式折疊， 所以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時無活性的蛋白質(zhì)分泌表達(dá)時卻具有活

32、性；蛋白質(zhì)信號肽和編碼序列之間能被切割，因 而分泌后的蛋白質(zhì)產(chǎn)物不含起始密碼所編碼的甲硫氨酸。產(chǎn)量不高，信號肽不被切割或不在特定位置上切 割。三、酵母中的基因表達(dá)1、載體酵母載體是可以攜帶外源基因在在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代細(xì)胞的DNA或RNA單 位。從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進(jìn)行的， 只有在最后階段在轉(zhuǎn)入酵母中。酵母載體有兩類：普通表達(dá)載體和精確表達(dá)載體。普通表達(dá)載體，只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物的組成，特別是對其氮末端氨基酸是否 有增減并無嚴(yán)格要求。精確表達(dá)載體，要求在啟動子或前導(dǎo)肽編碼序列的適

33、當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點，以利于接入外源基因，并使它 在表達(dá)和加工后氮末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸。2、影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素1、外源基因的拷貝數(shù)拷貝數(shù)要適當(dāng)，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體可使外源基因高效表達(dá)，但會引起細(xì)胞生長量的降低，單拷貝的質(zhì)粒 載體對細(xì)胞的最大生長沒有影響，能到達(dá)較高效的表達(dá)。2、外源基因的表達(dá)效率與啟動子、分泌信號、終止序列有關(guān)。要使外源基因在酵母中表達(dá)必須將外源基因克隆到酵母軍表達(dá)載體 的啟動子和終止子之間，構(gòu)成表達(dá)框架。分泌信號包括信號肽部分以及前導(dǎo)肽部分的編碼序列，它幫助后 面的表達(dá)產(chǎn)物分泌出酵母細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)牟课挥砂麅?nèi)蛋白酶加工切

34、斷表達(dá)產(chǎn)物與前導(dǎo)肽之間的肽鍵，產(chǎn) 生正確的表達(dá)產(chǎn)物。終止序列保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)牟课唤K止和加上多聚腺甘酸尾巴，這樣形成的mRNA可能比較穩(wěn)定并被有效地翻譯。3、外源蛋白的糖基化外源蛋白在分泌過程中發(fā)生糖基化。4、宿主菌株的影響宿主菌株應(yīng)具備以下要求：菌體生長力強(qiáng)；菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱；菌體性能穩(wěn)定；分泌能力強(qiáng)。 四、動物細(xì)胞中的基因表達(dá)動物細(xì)胞表達(dá)的特點：產(chǎn)物可分泌到細(xì)胞外，培養(yǎng)液成分可人工調(diào)控，產(chǎn)物純化比較容易，產(chǎn)物是糖基化 的，接近或類似于天然產(chǎn)物；但動物細(xì)胞生長慢，單位體積生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃 度較小。第五節(jié) 基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)

35、定的現(xiàn)象，有分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，分裂不穩(wěn)定是指工程 菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象；質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是指外源基因從質(zhì)粒上喪失或堿基重排、 缺失所致工程菌性能的改變。一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因常見的是分裂不穩(wěn)定，與兩個因素有關(guān)：含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；這兩種菌的比生長速率差 異的大小。含低拷貝質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率較大，增加工程菌中的質(zhì)粒拷貝數(shù)能提高質(zhì) 粒的穩(wěn)定性。含高拷貝質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率較低，但是大量外源質(zhì)粒的存在使含質(zhì)粒 菌的生長速率明顯低于不含質(zhì)粒菌，而不含質(zhì)粒菌一旦產(chǎn)生，能較快地取代含質(zhì)粒菌而成為優(yōu)勢菌，因而 對這類菌進(jìn)一步提高質(zhì)?？?/p>

36、貝數(shù)反而會增加含質(zhì)粒菌的生長負(fù)勢。質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法：將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，均勻涂布于不含抗性標(biāo)記抗生素的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-12小時，然后隨機(jī)挑出100個菌落接種到含抗性標(biāo)記抗生素的平板上，培養(yǎng) 10-12小時，統(tǒng)計長出 的菌落數(shù)，每一樣品應(yīng)取 3次重復(fù)的結(jié)果，計算出比值，該比值反映了質(zhì)粒的穩(wěn)定性。二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法采用兩階段法，第一階段先使菌體生長至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。在培養(yǎng)基中加入選擇 性壓力如抗生素等，以抑制質(zhì)粒喪失菌的生長。適當(dāng)?shù)牟僮鞣绞揭部墒构こ叹L速率具有優(yōu)勢，調(diào)控溫 度、pH、培養(yǎng)基組分、溶解氧，通過間歇供氧和改變稀釋速率都可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)

37、定性。第七節(jié)基因工程菌發(fā)酵基因工程菌的培養(yǎng)過程主要包括：1、通過搖瓶操作了解工程菌生長的基礎(chǔ)條件，分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對受體細(xì)胞的影響；2、通過培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制的方案以及順序。一、基因工程菌的培養(yǎng)方式1、補(bǔ)料分批培養(yǎng)將種子接入反應(yīng)器中后，培養(yǎng)一段時間，然后間歇或連續(xù)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長。為保持基 因工程菌生長所需的良好環(huán)境，延長對數(shù)生長期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和補(bǔ)料措施結(jié)合起來， 根據(jù)生長規(guī)律來調(diào)節(jié)補(bǔ)料速率。2、連續(xù)培養(yǎng)將種子接入反應(yīng)器后，培養(yǎng)一段時間，到一定菌濃，開動蠕動泵，同時進(jìn)料和出料，控制一定稀釋速率， 由于基因工程菌不穩(wěn)定，可將生長階段和基因表達(dá)

38、階段分開，進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng)，關(guān)鍵的控制參數(shù)是誘 導(dǎo)水平、稀釋率、細(xì)胞比生長速率。3、透析培養(yǎng)利用膜的半透性使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基別離，通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響。4、固定化培養(yǎng)基因工程菌固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高。便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對于分泌型菌更為有利。二、基因工程菌的發(fā)酵工藝基因工程菌培養(yǎng)目的是為了使外源基因大量表達(dá)，盡可能減少宿主細(xì)胞本身蛋白的污染，外源基因的高效表達(dá)，不僅涉及宿主、載體和克隆基因之間的相互關(guān)系，而且也其所處的環(huán)境也密切相關(guān)。不同的發(fā)酵條件，代謝途徑也不相同，對下游的純化工藝就會造成不同的影響。1、培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生

39、長速率，又要保持重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性，使外源基因能夠高效表達(dá)。使用不同的碳源對菌體生長和外源基因的表達(dá)有較大的影響，如葡萄糖做碳源菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)物較多，甘油做碳源菌體得率較大。酪蛋白水解物做氮源有利于產(chǎn)物的合成與分泌。無機(jī)磷在許多初級代謝的酶促反應(yīng)中是一個效應(yīng)因子，在低磷濃度下，盡管最大菌濃較低，但產(chǎn)物產(chǎn)率和產(chǎn)物濃度都較高。啟動子只有在低磷酸鹽時才被啟動。2、接種量的影響接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期，量小，延長菌體延遲期，不利于外源基因的表達(dá)；量大，有利 于對基質(zhì)的利用，可以縮短生長延遲期，并使產(chǎn)生菌能迅速占領(lǐng)整個培養(yǎng)環(huán)境，減少污染時機(jī)，但會使菌 體生長過快，代謝產(chǎn)物累積過多，反而會抑制后

40、期菌體的生長。3、溫度的影響溫度對基因表達(dá)的調(diào)控作用可發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或小分子調(diào)節(jié)分子的合成上。復(fù)制，可通過控制復(fù)制來改變基因拷貝數(shù)，影響基因的表達(dá)；轉(zhuǎn)錄，可通過影響RNA聚合酶的作用或修飾 RNA聚合酶，來調(diào)控基因表達(dá)。酶促反應(yīng)。4、溶解氧的影響菌體在大量擴(kuò)增過程中，進(jìn)行耗氧的氧化分解代謝，采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法可以改善培養(yǎng)過程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。在發(fā)酵前期采用較低轉(zhuǎn)速，即可滿足菌體生長，在培養(yǎng)后期，提高攪拌轉(zhuǎn)速才能滿足菌體繼續(xù)生長的要求。這樣既節(jié)約能源又可滿足各個不同階段菌體生長的要求。5、誘導(dǎo)時機(jī)的影響一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長期后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)，對數(shù)生長期，細(xì)胞快速繁殖，直

41、到細(xì)胞密度到達(dá)109個每毫升為止，這時菌群數(shù)目倍增，對營養(yǎng)和氧的需求量急增，營養(yǎng)和氧成了菌群旺盛代謝的限制因素。6、pH的影響兩階段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期著重于優(yōu)化工程菌的最正確生長條件，培養(yǎng)后期著重于優(yōu)化外源基因的表達(dá)，生長最正確期 pH6.8-7.4,外源蛋白表達(dá)時 pH 6.0-6.5。第九節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制基因工程藥物的特點：用活細(xì)胞作為表達(dá)體系，所獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)品往往相對分子量較大，并有復(fù)雜的結(jié) 構(gòu)，許多藥物是參與一些生理功能精密調(diào)節(jié)所必需的蛋白質(zhì)，所以任何藥物在性質(zhì)或劑量上的偏差，都可 能造成嚴(yán)重的后果，從原料開始每一步都要進(jìn)行嚴(yán)格的控制。一、原料的質(zhì)量控制原料的質(zhì)量控制是為了保

42、證編碼藥品的DNA序列的正確性，以及產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。根據(jù)質(zhì)量控制的要求，應(yīng)了解以下特征：目的基因的來源、克隆的經(jīng)過、并用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核 甘酸序列等予以確證、應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組分復(fù)制子、啟動子的來源與 功能、構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜、抗生素抗性標(biāo)志物、提供宿主細(xì)胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié) 果及其生物學(xué)特性，需闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)，如是否整合到染色體上 及在其中的拷貝數(shù)，并證明宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后遺傳穩(wěn)定性，提供插入基因與表達(dá)載體倆側(cè)端控制區(qū)內(nèi) 的核甘酸序列，詳細(xì)表達(dá)在生產(chǎn)過程中，啟動與控制克隆基因在宿主細(xì)胞表達(dá)的方

43、法與水平等。二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制儲存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；培養(yǎng)中，工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，表 達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物的污染。生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含致癌因子，無細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫。原始種子批需確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)表達(dá)種子批來源、方式、保存以預(yù)計使用期，保存與復(fù)蘇的方法和材料，并控制微生物污染；提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性 數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定在高允許傳代數(shù)；培養(yǎng)過程中，應(yīng)測定被表達(dá)基因分子的完整 性及宿主細(xì)胞長期培養(yǎng)后的基因型特征；依宿主細(xì)胞-載體穩(wěn)定性與

44、產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時間，并定期評價細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。三、純化工藝過程的質(zhì)量控制要有足夠的生理和生物學(xué)試驗數(shù)據(jù)，確證提純分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA與熱源質(zhì)都在規(guī)定的限度以下。在精制過程中能清除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)。四、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制藥物質(zhì)量控制包括以下要求：產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性、一致性。利用多學(xué)科的技術(shù)生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)。1、產(chǎn)品的鑒別肽圖分析：用酶法和化學(xué)方法降解目的蛋白，對生成的肽段進(jìn)行別離分析，檢測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中細(xì)微變化的最有效方法。靈敏、高效。高效液相色譜和毛細(xì)管電

45、泳。氨基酸成分分析：小于 50個氨基酸分析結(jié)果較可靠。部分氨基酸序列分析：氨基端15個氨基酸。重組蛋白質(zhì)的濃度測定和相對分子量測定：濃度，凱氏定氮法、雙縮月尿法、染料結(jié)合比色法、福林-酚法和紫外光譜法。分子量，凝膠過濾法完整和 SDS-PAG法亞基。蛋白質(zhì)二硫鍵分析：維持蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的重要共價鍵。2、純度分析包括目的蛋白質(zhì)含量測定和雜質(zhì)限量分析。1、目的蛋白，根據(jù)理化性質(zhì)和生物學(xué)特性。常用復(fù)原性及非復(fù)原性SDS等電聚焦、各種高效液相、毛細(xì)管電泳等。應(yīng)用兩種以上方法。2雜質(zhì)，包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)雜質(zhì)。蛋白類，宿主細(xì)胞蛋白，采用免疫方法和電泳相結(jié)合；非蛋白類， 病毒、細(xì)菌等微生物、熱源質(zhì)、內(nèi)毒素

46、、致敏原及DNA。利用微生物學(xué)方法檢測無菌。熱源質(zhì)檢測用家兔注射。3、生物活性測定10 需要動物體內(nèi)實驗和通過細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行體外效價測定。重組蛋白質(zhì)是一種抗原，可用放射免疫分析法或酶 標(biāo)法測定其免疫學(xué)活性。體內(nèi)生物學(xué)活性的測定要根據(jù)目的產(chǎn)物的生物學(xué)特性建立適合的生物學(xué)模型，體 外生物活性測定有細(xì)胞計數(shù)法等。4、穩(wěn)定性考察是評價藥品要效性按安全性的重要指標(biāo)，也是確定藥品儲藏條件和使用期限的主要依據(jù)。對溫度、氧化、 光照、離子濃度和機(jī)械剪切等環(huán)境因素都很敏感。5、產(chǎn)品一致性的保證生產(chǎn)周期長，影響因素多，必須對每一步都進(jìn)行嚴(yán)格的控制。五、產(chǎn)品的保存目的產(chǎn)物受多種因素的影響而失活，保存時要防止變性、降解

47、、保護(hù)活性中心。1、液態(tài)保存低溫保存：對熱敏感。在穩(wěn)定pH條件下保存：防止變性。高濃度保存：高濃度時比較穩(wěn)定。加保護(hù)劑保存：糖類、脂肪類、蛋白質(zhì)類、多元醇、有機(jī)溶劑等。有些需要加鹽，加2-疏基乙醇在真空或惰性氣體中保存。2、固體保存固體蛋白質(zhì)比液體穩(wěn)定，在室溫或冰箱中保存比較穩(wěn)定，長期保存最好制成干粉或結(jié)晶。六、基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用1、提高抗生素產(chǎn)量工業(yè)使用的抗生素產(chǎn)生菌都是通過物理或化學(xué)方法誘變后得到的，如果利用基因工程技術(shù)有目的地定向改 造基因，提高基因的表達(dá)水平以改造菌種的生產(chǎn)能力效果會更好?？蛇M(jìn)行以下幾方面的工作。1、將產(chǎn)生菌基因隨即克隆到原株直接篩選高產(chǎn)菌在克隆菌株中，增加某

48、一與產(chǎn)量有關(guān)的基因劑量，使產(chǎn)量得到提高。2、增加參與生物合成限速階段基因的拷貝數(shù)抗生素生物合成途徑中的某個階段可能是整個合成中的限速階段，識別位于合成途徑中的限速瓶頸，并設(shè) 法導(dǎo)入能提高這個階段酶系的基因拷貝數(shù)，如果增加的中間產(chǎn)物不對合成途徑中某個步驟產(chǎn)生反饋抑制， 就有可能增加最終抗生素的產(chǎn)量。3、通過調(diào)節(jié)基因的作用調(diào)節(jié)基因的作用可增加或降低抗生素的產(chǎn)量，正調(diào)節(jié)基因可能通過一些正調(diào)控機(jī)制對結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行正向調(diào) 節(jié)，加速抗生素的產(chǎn)生，負(fù)調(diào)節(jié)基因可能通過一些負(fù)調(diào)控機(jī)制對結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)，降低抗生素的產(chǎn) 量，因此，增加正調(diào)節(jié)基因或降低副調(diào)節(jié)基因的作用，可增加抗生素的產(chǎn)量。4、增加抗性基因抗性基因

49、可通過其產(chǎn)物滅活胞內(nèi)或胞外的抗生素，保護(hù)自身免受所產(chǎn)生的抗生素的殺滅作用，有些抗性基 因的產(chǎn)物還直接參與抗生素的合成，抗性基因經(jīng)常和生物合成基因連鎖，而且它們的轉(zhuǎn)錄有可能也是緊密 相連的，是激活生物合成基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的必須成分?？剐曰虮仨毷紫冗M(jìn)行轉(zhuǎn)錄，建立抗性后，生物合成 基因的轉(zhuǎn)錄才能進(jìn)行?？股氐漠a(chǎn)生與菌種對其自身抗生素的抗性密切相關(guān)?？股氐纳a(chǎn)水平是由抗生 素生物合成酶和對自身抗性的酶所共同確定，這就為通過提高菌種自身抗性水平來改進(jìn)菌種，提高抗生素 產(chǎn)量提供了依據(jù)。2、改善抗生素組分許多抗生素產(chǎn)生菌可產(chǎn)生多組分抗生素，由于這些組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相似，而其生物活性有時卻相差很大，這

50、給有效組分的發(fā)酵、提取和精制帶來了很大不便。隨著對抗生素生物合成途徑和深入了解及基因重組技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)用基因工程技術(shù)可以定向地改造抗生素產(chǎn)生菌，獲得只產(chǎn)生有效組分的菌種。3、改進(jìn)抗生素生產(chǎn)工藝11 抗生素的合成一般對氧的供給較為敏感，不能大量供氧往往是高產(chǎn)發(fā)酵的限制因素。為了使細(xì)胞處于有氧 呼吸狀態(tài)，傳統(tǒng)方法是：改變最適操作條件；降低細(xì)胞生長速率；培養(yǎng)密度。提高供氧水平只能從設(shè)備和 操作角度考慮，提高溶氧水平或氣液傳質(zhì)系數(shù)，提高發(fā)酵罐中無菌空氣的通入量，并采用各種攪拌裝置， 使空氣分散，滿足菌體生長的要求?？諝獾膲嚎s、冷卻或過濾、攪拌都要消耗大量的能源，結(jié)果并不理想。 進(jìn)入液相的氧分子需要

51、穿過幾層膜才能到達(dá)菌體，進(jìn)入菌體后，還要經(jīng)物理擴(kuò)散才能到達(dá)產(chǎn)生能量的呼吸 細(xì)胞器。如在菌體內(nèi)導(dǎo)入與氧有親和力的血紅蛋白，呼吸細(xì)胞就能容易的獲得足夠的氧，降低細(xì)胞對氧的 敏感程度，利用它改善發(fā)酵過程中溶氧的控制程度。利用基因重組技術(shù)克隆血紅蛋白基因到抗生素產(chǎn)生菌 中，在細(xì)胞中表達(dá)血紅蛋白，可以從提高細(xì)胞自身代謝功能入手解決溶氧供求矛盾。4、產(chǎn)生雜合抗生素不同抗生素合成基因重組；生物合成途徑中某個酶基因的突變；在生物合成途徑中引入一個酶基因；利用 底物特異性不強(qiáng)的酶催化形成新產(chǎn)物?；蚬こ炭贵w的類型有 1.人-鼠嵌合抗體；2.改形抗體；3.小分子抗體；4.雙功能抗體；5.抗體融合蛋白第二節(jié)動物細(xì)胞

52、的形態(tài)和生理特點一、動物細(xì)胞的形態(tài)動物細(xì)胞屬于真核細(xì)胞，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分化精確，不同細(xì)胞執(zhí)行不同的功能，例如神經(jīng)細(xì)胞具有很長的分支， 很多的纖維，以便接受和傳遞刺激，紅細(xì)胞呈扁圓盤狀，增大其接觸面等。但細(xì)胞在離體培養(yǎng)時形態(tài)會發(fā) 生變化，根據(jù)不同的需要將離體培養(yǎng)的細(xì)胞分為兩類：貼壁依賴型和貼壁非依賴型，或貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì) 胞。1、貼壁細(xì)胞生長時必須要有給以貼附的支持物外表，細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該外表上生長和繁殖，細(xì)胞在外表上生長時有兩種形態(tài)，成纖維樣細(xì)胞型和上皮樣細(xì)胞型。成纖維樣細(xì)胞型主要來源于中胚層組織細(xì)胞心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞成骨細(xì)胞等，上皮樣細(xì)胞型主要來源于 外胚層和

53、內(nèi)胚層組織細(xì)胞，皮膚細(xì)胞、腸管上皮細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中，隨著培養(yǎng)條件的變化細(xì)胞形態(tài)也會 發(fā)生改變。2、懸浮細(xì)胞生長不依賴支持物外表，在培養(yǎng)液中懸浮生長，如淋巴細(xì)胞等。3、兼性貼壁細(xì)胞根據(jù)生長條件的不同可貼壁也可懸浮生長，中國地鼠卵巢細(xì)胞。第三節(jié)生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求和獲得一、要求最初要求生產(chǎn)用動物細(xì)胞必須是原代細(xì)胞，以后放寬至二倍體細(xì)胞即可，即使是經(jīng)過多次傳代也可用，但是非二倍體細(xì)胞是絕對禁止使用的，因為擔(dān)憂異倍體細(xì)胞的核酸會影響到人的正常染色體，有致癌的危險，由于二倍體細(xì)胞傳代不會超過 50代，所以使用受到限制。后來發(fā)現(xiàn)異倍體也可使用，并未對機(jī)體產(chǎn)生影響, 并且可無限使用，對工業(yè)生產(chǎn)帶來了極大的

54、方便。二、獲得原代細(xì)胞、已建立的二倍體細(xì)胞系及可無限傳代的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。1、原代細(xì)胞直接取自動物組織、器官，經(jīng)過粉碎、消化后獲得的細(xì)胞懸液。需大量動物，費錢費勞力。2、二倍體細(xì)胞原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選和克隆，從而從多種細(xì)胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。特點：二倍體；有明顯的貼壁和接觸抑制特性；有限的增殖能力；無致瘤性。3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系12 通過轉(zhuǎn)化形成，變成了異倍體，有無限增殖能力。轉(zhuǎn)化可自發(fā)，在傳代過程中自己轉(zhuǎn)變成可無限增殖的細(xì)胞；也可人為轉(zhuǎn)化，采用某些試劑處理，或從動物的腫瘤組織中建立的細(xì)胞系。優(yōu)點：無限傳代、倍增時間短、對培養(yǎng)條件和生長因子的要求低，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)

55、。三、常用生產(chǎn)用動物細(xì)胞的特性WI-38 :人二倍體細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，倍增時間為24小時，有限壽命50代，用于制備疫苗。MRC-5:人二倍體細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞，有限壽命 42-46代，用于制備疫苗。CHO-K1:從中國地鼠卵巢中別離的上皮樣細(xì)胞，用于構(gòu)建工程菌。BHK-21:從地鼠幼鼠的腎臟中別離。成纖維樣細(xì)胞，用于構(gòu)建工程菌，可生產(chǎn)疫苗。Vero：從非洲綠猴腎中別離，貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，用于制備疫苗。Namalwa :從淋巴瘤病人別離，生產(chǎn)干擾素。SP20-Ag14:從抗羊紅細(xì)胞活性的小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系融合獲得，生產(chǎn)單克隆抗體。四、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選生產(chǎn)中常采用融

56、合細(xì)胞或基因工程構(gòu)建的工程菌1、真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建常用病毒或質(zhì)粒載體， 用桿狀病毒作載體的優(yōu)點：該病毒基因是雙鏈的容易進(jìn)行重組；插入7-8千堿基對不影響正常病毒的形成；可用外源基因更換部分病毒基因，仍具有感染力；有很強(qiáng)的啟動子；用光學(xué)顯微鏡可見，容易挑選陽性克?。豢芍苯颖磉_(dá)外源基因。構(gòu)建穿梭質(zhì)粒載體的基本成分：允許載體在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列；含有能使基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控元件；能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記；有時還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。2、基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞的篩選融合法、化學(xué)法、物理法、病毒法。最常用磷酸鈣沉淀和電穿孔法。磷酸鈣沉淀法，將溶解的 DNA加在磷酸氫

57、二鈉溶液中，再逐漸加入氯化鈣溶液，當(dāng)磷酸氫二鈉和氯化鈣形成磷酸鈣沉淀時，DNA被包裹在當(dāng)中，形成 DNA磷酸鈣共沉淀。當(dāng)沉淀物與細(xì)胞外表接觸時，通過細(xì)胞吞噬作用將DNA導(dǎo)入其中。優(yōu)點是方法簡單、可進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，可將不含選擇性標(biāo)記的DNA和含選擇性標(biāo)記的DNA放在一起進(jìn)行形成混合的共沉淀物，一起導(dǎo)入細(xì)胞。電穿孔法，借助電穿孔儀產(chǎn)生的高壓脈沖電場，使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時可逆性的小孔，外源DNA即可進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化效率較高，但進(jìn)入的 DNA拷貝數(shù)較低。依靠構(gòu)建載體內(nèi)的選擇性標(biāo)記采用相應(yīng)的篩選系統(tǒng)：HAT、GPT G418、MTX篩選相應(yīng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；對選出的細(xì)胞要進(jìn)行克隆和亞克隆使其純化。五、細(xì)胞庫的建立除原代

58、細(xì)胞外，其他細(xì)胞株、細(xì)胞系，包括二倍體、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、融合細(xì)胞和工程細(xì)胞都需建立細(xì)胞庫保存。用于生產(chǎn)的工程細(xì)胞必須建立兩個細(xì)胞庫，原始細(xì)胞庫和生產(chǎn)用細(xì)胞庫。原始細(xì)胞庫應(yīng)有詳細(xì)檔案：1、該細(xì)胞系的歷史：來源、動物的年齡和性別、細(xì)胞別離的方法和所用的培養(yǎng)材料。2、該細(xì)胞的特性：形態(tài)、生長特性。3、對各種有害因子的檢查結(jié)果，細(xì)菌、真菌、支原體和各種病毒。生產(chǎn)用細(xì)胞庫的細(xì)胞來源與原始細(xì)胞庫，然后經(jīng)擴(kuò)增達(dá)一定數(shù)量后，再分裝形成細(xì)胞庫。第四節(jié)動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基一、動物細(xì)胞在體外培養(yǎng)所需條件1、所有的與細(xì)胞接觸的設(shè)備、器材和溶液都必須保持絕對無菌，防止污染；2、必須有足夠的營養(yǎng)保證，絕對不可有有害的物質(zhì)

59、，防止有害離子；3、保證有食量的氧氣供給；4、需隨時清除細(xì)胞代謝中的有害產(chǎn)物；5、有良好的適于生存的外界環(huán)境，滲透壓、離子濃度和酸度；6、及時分種，保持合適的細(xì)胞密度。二、動物培養(yǎng)基的種類和組成天然、合成和無血清培養(yǎng)基。131、天然培養(yǎng)基：血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。2、合成培養(yǎng)基：組成穩(wěn)定可、大量生產(chǎn)供給。成分為氨基酸細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料、維生素維持細(xì)胞生命活動的低分子活性物質(zhì)，形成酶的輔基或輔酶、糖類碳源、無機(jī)鹽保持細(xì)胞的滲透壓并參與代謝、其他前體和氧化復(fù)原劑。合成培養(yǎng)基中除了各種營養(yǎng)成分外，還需添加5%-10%的小牛血清。3、無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基在天然或合成培養(yǎng)基的

60、基礎(chǔ)上添加激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼附和伸展因子及其他元素。無血清培養(yǎng)基優(yōu)點：提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，防止了血清差異所帶來的細(xì)胞差異；減少了由血清帶來 的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險；供給充足、穩(wěn)定；細(xì)胞產(chǎn)品易于純化；防止了血清中某些因 素對有些細(xì)胞的毒性；減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于結(jié)果分析。添加小牛血清的作用：1、提供有利于細(xì)胞生長增殖所需的各種生長因子和激素；2、提供有利于細(xì)胞貼壁所需的貼附因子和伸展因子； 3、提供可識別金屬、激素、維生素和脂類的結(jié)合蛋白；4、提供細(xì)胞生長所必需的脂肪酸和微量元素。第五節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)方式和操作方式一、動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法根據(jù)