PCR技術(shù)概述授課課件

1、PCR技術(shù)概述授課課件PCR技術(shù)概述授課課件 PCR（Polymerase Chain Reaction)技術(shù)即聚合酶鏈反應(yīng)，又稱DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。 1985年由美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明的一種具有劃時(shí)代意義的分子生物學(xué)技術(shù)，被譽(yù)為無細(xì)胞分子克隆。 PCR（Polymerase Chain Reac一、PCR技術(shù)的創(chuàng)建 Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。 1985年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。 1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù) 1

2、989年美國Science雜志列PCR 為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。一、PCR技術(shù)的創(chuàng)建 Khorana(1971)等提三篇重要論文The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction (Scientific American, 1990,262(4):56-61, 64-5 )Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase (Science,1988,239(

3、4839):487-91 ) Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Methods in Enzymology, 1987,155:335-50 )三篇重要論文The Unusual Origin of th引物引物1983年 Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段引物引物1983年 Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合94變性50-65退火XX延伸94變性50-65退火XX延伸DNA聚合酶：大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，缺點(diǎn)：Klen

4、ow酶不耐高溫， 90會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加入。引物鏈延伸反應(yīng)在37下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。 DNA聚合酶：大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行P1988年Sai

5、ki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。 此酶特點(diǎn)：耐高溫，在70下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。1988年Sai

6、ki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thTaq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)溫度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶二、PCR技術(shù)的原理1 PCR技術(shù)的基本原理 在微量離心管中,加入適量的緩沖液, 微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶, 一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍; 擴(kuò)增了特異區(qū)段的DNA帶。 二、PCR技術(shù)

7、的原理1 PCR技術(shù)的基本原理 在微 體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶 dNTP解旋酶類引物5 3知識(shí)點(diǎn)回顧 體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶 dNTP解旋酶類加熱變 性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強(qiáng)酸、堿性作用可以使 DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為 DNA的變性。解除變性的條件后, 變性的單鏈可以重新結(jié)合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱DNA復(fù)性, 也叫退火。 加熱變 性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強(qiáng)酸、堿性作用可以PCR擴(kuò)增原理引物延伸延伸5533變性、退火變性、退火PCR擴(kuò)增原理引物延伸延伸5533變性、退火變性、退2 PCR技術(shù)的特點(diǎn)1）高度的

8、靈敏性30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍2 PCR技術(shù)的特點(diǎn)1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)2302 ）特異性 引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。 引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。引物引物2 ）特異性 引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR3535限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列啟動(dòng)子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記3535限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列3）操作簡便易行 PCR擴(kuò)增法,只需要數(shù)小時(shí),就可以用電泳法檢出1g基因組DNA中僅含數(shù)個(gè)拷貝的模板序列。 通常的DNA擴(kuò)增法是分子克隆法, 首先要構(gòu)建含有

9、目的的基因的載體, 然后將它導(dǎo)入細(xì)胞后進(jìn)行擴(kuò)增,還要用同位素探針進(jìn)行篩選;這種方法,要經(jīng)過DNA內(nèi)切、連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過程,操作復(fù)雜,一般需要數(shù)周時(shí)間。3）操作簡便易行 PCR擴(kuò)增法,只需要數(shù)小時(shí),就可以用電目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴(kuò)增擴(kuò)增提取DNA分子目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴(kuò)增擴(kuò)增提取DNA分子4）對標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑酶鞣N生物標(biāo)本（如血液、體腔液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等）粗制的DNA擴(kuò)增檢測。4）對標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA5 ）用途廣泛生命學(xué)科醫(yī)學(xué)工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學(xué)

10、考古學(xué)5 ）用途廣泛生命學(xué)科三、PCR的反應(yīng)體系和方法 PCR管加熱使模板變性, 退火使引物與模板DNA互補(bǔ),延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈。 如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍; 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。三、PCR的反應(yīng)體系和方法 PCR管加熱使模板變性, 退 總體積 50-100 l Buffer 緩沖液 dNTP 原料 Pri

11、mer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 1 反應(yīng)體系 總體積 PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNA dNTP 引物Buffer預(yù)變性模板DNA dNTP 引物BufferTaqDNA聚合酶94oC2 基本過程PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNA 預(yù)變性模板DNA TaPCR技術(shù)的基本過程(2)Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer循環(huán)儀9455 72 Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer72 57 min循環(huán)2535次PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq 酶循環(huán)儀94Taq 酶7瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)（

12、1）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 一般100ng DNA模板/100L。 模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。3 PCR反應(yīng)條件（1）模板3 PCR反應(yīng)條件（2）引物引物合成的質(zhì)量 PCR所用引物質(zhì)量較高，且需純化。 合成的引物必須經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或反向高效液相層析純化，減少發(fā)生非特異擴(kuò)增和信號(hào)強(qiáng)度的降低。 凍干引物于-20可以保存12-24個(gè)月，甚至更長，液體狀態(tài)-20可以保存6個(gè)月或更長。 （2）引物引物設(shè)計(jì)的一般原則（1)引物長度 特異性一般通過引物長度和退火溫度來控制。長度以15-40 bp為宜。 引物長度增加，能提高

13、特異性，但在退火時(shí)被引發(fā)的模板會(huì)減少，降低反應(yīng)效率。 實(shí)際應(yīng)用中最適延伸溫度不要超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74）。引物設(shè)計(jì)的一般原則（2）引物的3末端和5末端核苷酸 引物3端為關(guān)鍵堿基，是PCR延伸的起始端，不能進(jìn)行任何修飾，也不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能，一般3端也不能發(fā)生錯(cuò)配； 5端無嚴(yán)格限制，只起限定PCR產(chǎn)物長度的作用，對擴(kuò)增特異性影響不大，可以被修飾。（2）引物的3末端和5末端核苷酸（3）GC的含量 一對引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)， G+C一般占40-60%。 根據(jù)公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,可估計(jì)引物的Tm值。（3）GC的含量（4）兩引物間避免有互補(bǔ)序列，尤其避免3

14、端的互補(bǔ)重疊。 一般來講，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能超過3個(gè)，一對引物間也不易多于四個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ)性。（4）兩引物間避免有互補(bǔ)序列，尤其避免3端的互補(bǔ)重疊。（5）堿基的隨機(jī)分布 選擇缺乏連續(xù)單一核苷酸的區(qū)域作為引物序列，這樣可以減少引物-引物同源互補(bǔ)的機(jī)會(huì)。 也要注意引物在長度和堿基組成上的平衡，兩個(gè)引物的Tm值相差2-3范圍內(nèi)。（5）堿基的隨機(jī)分布（6）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 采用計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測估計(jì)mRNA的穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。（6）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物濃度0.1-1 mol/L 引物濃度過低，PCR產(chǎn)物量下降。濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降，還會(huì)

15、增加引物二聚體的形成。非特異性產(chǎn)物和引物二聚體又可作為PCR反應(yīng)的底物，與靶序列競爭DNA聚合酶和dNTP底物，使靶序列的擴(kuò)增量降低。引物濃度0.1-1 mol/L（3）循環(huán)參數(shù)變性的時(shí)間與溫度 不同的DNA解鏈溫度不同，由于DNA中GC與AT的比例不同引起的。GC比例越大，解鏈溫度越高。 一般GC含量每增加1%，解鏈溫度就增加0.4。 典型的變性條件是95 30s或97 15s。（3）循環(huán)參數(shù)變性的時(shí)間與溫度過高使聚合酶失去活性，過低DNA變性不完全。變性溫度在90-95 時(shí)，既能保證使DNA雙鏈模板變性，又能保持Taq聚合酶活力。因此PCR變性溫度在90-95 之間選擇，時(shí)間為30-60s

16、。過高使聚合酶失去活性，過低DNA變性不完全。退火時(shí)間與溫度退火溫度決定著PCR的特異性。 引物復(fù)性所需的溫度與時(shí)間取決于引物的堿基組成、長度。范圍一般在25-65，低于引物Tm值5 左右。在典型的引物濃度時(shí)，退火時(shí)間一般為40-90s，過短會(huì)導(dǎo)致引物與模板DNA互補(bǔ)配對失敗。退火時(shí)間與溫度退火溫度決定著PCR的特異性。延伸時(shí)間與溫度延伸時(shí)間的長短取決于待擴(kuò)增的模板序列的長度與濃度，以及延伸溫度高低。引物延伸在70-74下進(jìn)行，根據(jù)擴(kuò)增DNA的長度而確定，一般延伸30-90s。延伸時(shí)間與溫度延伸時(shí)間的長短取決于待擴(kuò)增的模板序列的長度與循環(huán)次數(shù)的確定以既達(dá)到擴(kuò)增效果又盡量減少非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增為

17、原則，PCR的循環(huán)次數(shù)一般在25-35次。循環(huán)系數(shù)過多將增加非特異產(chǎn)物；循環(huán)次數(shù)太少，產(chǎn)率偏低。因此在得到足夠產(chǎn)物的條件下應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)的確定以既達(dá)到擴(kuò)增效果又盡量減少非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94 30s 55 45s72 1min94 5min30次72 7min4 forever經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94 30（4）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。 催化DNA合成的溫度以70-80為宜。高于90時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。（4）Taq DNA

18、聚合酶（thermus aquaticu（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。 Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。 Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度，可適當(dāng)提高M(jìn)g2+的用量。（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。（6）dNTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度，一般為50-200umol/L; 四種dNTP濃度應(yīng)相等,過高或過低導(dǎo)致錯(cuò)誤滲入增加，終止反應(yīng)； 濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量；

19、 dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。（6）dNTP（7）其他輔助試劑加入一定濃度的添加劑如DMSO（二甲基亞砜）、甘油或甲酰胺等，可提高PCR擴(kuò)增效率及特征性。 可能是消除了引物和模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)，降低DNA雙鏈的解鏈溫度，使DNA雙鏈完全變性所致。還可加入牛血清白蛋白、明膠、Tween20或二硫蘇糖醇（DTT），有助于酶的穩(wěn)定。（7）其他輔助試劑加入一定濃度的添加劑如DMSO（二甲基亞砜1）不對稱PCR 目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關(guān)鍵是限制性引

20、物的絕對量。 四、PCR的類型1）不對稱PCR 四、PCR的類型2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。 可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶3）多重PCR（復(fù)合PCR） 在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的

21、PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同. 3）多重PCR（復(fù)合PCR） 在同一PCR反應(yīng)體系用于檢測特定基因序列的存在或缺失。 或用于多種病原微生物的同時(shí)檢測或鑒定，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。多種病原微生物的同時(shí)檢測或鑒定，是在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？捎糜谕瑫r(shí)檢測多種病原體或鑒定出是那一型病原體感染。 用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物12341234電泳引物123412344）LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、熒光素等對PCR引物5端進(jìn)行標(biāo)記，據(jù)此檢測目的基因的存在與否. 一次可以同時(shí)

22、分析多種基因成分，因而特別適合于大量臨床標(biāo)本的基因診斷。目前該方法只對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性鑒定。 病毒1 病毒2 病毒 3 病毒44）LP-PCR（Labelled primers) 標(biāo)記引物觀察PCR產(chǎn)物標(biāo)記引物觀察PCR產(chǎn)物5）錨定PCR（anchored PCR, A-PCR）PCR的局限：需了解靶基因片段兩測的序列 對于未知序列和具有不同末端序列怎么辦？（固定化PCR）5）錨定PCR（anchored PCR, A-PCR）PCVHCH1CH1CH2CH2CH3CH3VHVLVLCLCLVHCH1CH1CH2CH2CH3CH3VHVLVLCLCLcDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3GGGG5CCCC

23、 錨定引物3GGGG5CCCC3GGGGCCCC錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對的3錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點(diǎn)polydC)一起作PCR擴(kuò)增cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3GGGG5CCCC 錨定引帶有PolyC尾巴的引物是一個(gè)固定點(diǎn)，它可以并與PolyG尾巴結(jié)合，無論其余部分序列如何，只識(shí)別片段末端，利用此法可從前述mRNA中檢出至少20種不同序列，每一種都是獨(dú)特的，表明A-PCR不對任何特殊序列有傾向性結(jié)果，可用于T細(xì)胞、腫瘤及其它部位抗體基因的研究。 帶有PolyC尾巴的引物是一個(gè)固定點(diǎn)，它可以并與PolyG尾6）PCR固相分析法模板生物素

24、化引物PCR擴(kuò)增探針親和固相介質(zhì)檢測探針信號(hào)可用于基因芯片的制作6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴(kuò)增探針親和固相介7）原位 原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。 直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。 適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列7）原位 原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（In Still P 原位PCR的作用 既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH）,但在每個(gè)細(xì)

25、胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下,該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列,敏感度很高,但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。 ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來,成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。利用該法可檢測細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。 原位PCR的作用操作步驟1. 細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2. PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3. 原位雜交檢測擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達(dá)操作步驟A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達(dá)8）（逆轉(zhuǎn)錄-PCR）