細胞試驗操作流程

1、細胞凍存、復(fù)蘇及傳代操作流程.試劑與儀器：試齊IPBS磷酸緩沖液：Solarbio,貨號：P1022胰蛋白酶-EDTA溶液：Gibco公司，貨號15400054 100 mL;青鏈霉素：Gibco公司，貨號15140-112 100 mL;FBS: Gibco 公司，貨號 10091-148 500 mL;DMEM （4.5g/L glucose）培養(yǎng)基：CORNING 公司，貨號 10-013-CVR 500 mL;RPMI 1640 : CORNING 公司，貨號 10-040-CVR 500mL;DMSO: SIGMA 公司，貨號：D8418;PBS磷酸緩沖液：Solarbio,貨號：P

2、1022儀器生物安全柜：離心機：37 c恒溫水浴箱：-80 C冰箱：4c冰箱：熒光倒置顯微鏡：37 c恒溫培養(yǎng)箱：液氮罐：2、實驗方法：細胞凍存配制含10% 體積DMSO的凍存培養(yǎng)液（90% FBS+10% DMSO或70%培養(yǎng) 基+20%FBS+10%DMSO）,凍存盒室溫放置。將正常生長的貼壁細胞用 PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA （6 cm皿加 入1 mL, 10 cm皿或T25細胞瓶加入2 mL） , 37c放置直至細胞顯微鏡下縮成 圓球狀，加入消化液體積2倍以上培養(yǎng)基，終止消化，將細胞吸取至 15 mL離心管中，800 rpm離心5 min,去上清加入適量凍存液重懸細胞，1m

3、L分裝于凍存管中，做好標(biāo)記。懸浮細胞收集細胞培養(yǎng)液于15 mL離心管中，800 rpm離心5 min ,去上清 加入適量凍存液重懸，1 mL分裝于凍存管中，做好標(biāo)記。將凍存管放入凍存盒中，放入-80C過夜，第二天轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。細胞復(fù)蘇從液氮罐中取出凍存管，快速浸入 37c溫水中，并不時搖動令其盡快融化； 從37c水浴中取出凍存管，在安全柜中，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加 到15 mL離心管中（15 mL離心管中已事先加入4 mL培養(yǎng)基）混勻，800 rpm, 離心5 min,棄去上清液，加入含10%血清的培養(yǎng)液重懸細胞，根據(jù)離心后的細 胞沉淀，將細胞培養(yǎng)在10 cm皿或6 cm皿的培

4、養(yǎng)皿中（一般選用6 cm皿）37C 培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。次日更換1次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。細胞傳代狀態(tài)良好的貼壁細胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA （6cm皿加入1 mL, 10 cm皿或T25細胞瓶加入2 mL）, 37c放置直至細胞顯微鏡下縮成圓球 狀，加入胰酶體積2倍以上培養(yǎng)基，終止消化，將細胞吸取至15 mL離心管中，800 rpm離心5 min,去上清加入1-2ml 培養(yǎng)基重懸細胞，吹打均勻后根據(jù)細胞生 長速度1瓶傳2瓶或1瓶傳3瓶，補齊培養(yǎng)基（6cm皿加5ml, 10cm皿加10ml） 后放入37 c培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。懸浮細胞在顯微鏡下觀察，健康的細胞干凈而透明，核清晰可見，靜置培

5、養(yǎng) 時常見小細胞團。若細胞狀態(tài)好，培養(yǎng)基干凈而無明顯顆粒物沉淀，可直接 1:2或1:3分瓶 傳代培養(yǎng)。若細胞有碎片，培養(yǎng)基中顆粒物多，則需收集細胞培養(yǎng)液于15ml離心管中，600rpm離心5min,去上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸，輕柔吹打混勻后， 根據(jù)細胞生長速度，1:2或1:3傳代培養(yǎng)。3、注意事項1）細胞一旦染菌后直接舍棄并檢查所有試劑耗材是否污染，如細胞樣本非常珍貴可考慮按下列操作搶救挽回，搶救過程染菌風(fēng)險極高千萬要小心謹慎及時換掉已受污染的培養(yǎng)基，PBS清洗7-8次，洗至顯微鏡下觀察看不到一顆 細菌為宜，清洗后用高濃度雙抗（20X）浸泡5分鐘，PBS清洗兩次，用含2X 雙抗的完全培養(yǎng)基

6、另外添加抗支原體藥和慶大霉素進行培養(yǎng)；2）細胞消化過程需緊密觀察細胞狀態(tài)，避免消化過度導(dǎo)致細胞死亡，消化時 間在1-10分鐘不等。3）細胞凍存密度一般控制在1X106個/ml,可按實驗需要進行調(diào)整，盡量不要 低于1X105個/ml,防止因細胞過于稀疏而導(dǎo)致的復(fù)蘇失敗。4）細胞培養(yǎng)過程中如發(fā)現(xiàn)因細胞狀態(tài)不佳導(dǎo)致的培養(yǎng)基底部出現(xiàn)黑點雜質(zhì)，可將細胞消化下來后用PBS重懸，低轉(zhuǎn)速（500rpm, 3min）離心，重復(fù)兩次。細胞遷移操作流程1、實驗原理：將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上 室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。 我們將

7、細胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影 響到上室內(nèi)的細胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養(yǎng)、細胞趨化、 細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。Transwell遷移實驗常用8.0、12.0膜，上室種月中瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，月中瘤細胞會向營養(yǎng) 成分高的下室跑，計數(shù)進入下室的細胞量可反映月中瘤細胞的遷移能力。2、實驗材料與儀器：試劑PBS磷酸緩沖液胰酶；FBS:Transwell 板 （24 孑L板，孑L徑 8um） ： Corning Incorporated公司。0.

8、1%結(jié)晶紫：SIGMA公司。4%多聚甲醛：SIGMA公司。儀器臺式低速離心機：二氧化碳培養(yǎng)箱：細胞培養(yǎng)皿：Thermo公司；倒置顯微鏡：生物安全柜：3、實驗方法:實驗流程細胞前處理Transwell接種培養(yǎng)拍照分析實驗步驟(1)消化收集細胞，1000rpm離心5min；(2)用1XPBS清洗一次，用對應(yīng)空白培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為 1M05-1 X06 個/ml;(3)選擇孔徑大小為8.0小的transwell板，上室加入100/L細胞懸液,下室加 600仙L含血清的培養(yǎng)基彳為趨化因子，37 c 5%CO2孵育；(4) 24-48h (最遲不超過48h)后取出小室，用1 XPBS清

9、洗三次；(5)用4%多聚甲醛固定30min,用1XPBS清洗三次；(6) 0.1%結(jié)晶紫染色30min,用1XPBS清洗三次，使用棉簽去除濾膜表面未穿 膜細胞；(7)拍照(200X)計數(shù)。4、注意事項1)每個細胞遷移能力不同，本實驗需先做預(yù)實驗摸清鋪入的細胞密度，大部分月中瘤細胞可發(fā)生遷移的細胞數(shù)目在 2-8萬個/孔。2)用棉簽擦除濾膜表面未穿膜細胞時動作一定要輕柔，濾膜本身柔軟易變形， 一旦用力過大導(dǎo)致濾膜變形，后續(xù)顯微鏡拍照時便無法細胞將聚焦在同一平面 內(nèi)，導(dǎo)致實驗失敗。細胞劃痕操作流程1、實驗原理細胞劃痕實驗(Wound Healing)是一種操作簡單，經(jīng)濟實惠的研究細胞遷移/ 月中瘤侵

10、襲的體外試驗方法。這種方法的原理是，當(dāng)細胞長到融合成單層狀態(tài)時， 在融合的單層細胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕”。劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區(qū)域使“劃痕”愈合。 基本的步驟包括“劃痕”的制造，細胞遷移 期間圖像的獲得以及后期數(shù)據(jù)的處理。2、實驗材料與儀器：試劑培養(yǎng)基： Corning 公司；雙抗(青霉素、鏈霉素)：Gibco公司；胰酶：0.5%Trypsin-EDTA, Gibco 公司;記號筆直尺儀器生物安全柜：離心機：倒置顯微鏡：c恒溫培養(yǎng)箱：3、實驗方法:實驗流程實驗步驟(1)先用記號筆在6孔板背面，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔0.51cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過 4條

11、線；(2)取生長對數(shù)期細胞消化計數(shù)鋪六孔板，貼壁過夜，控制第二天細胞密度達100%;(3)第二天用10仙或200小槍頭比著6孔板蓋，盡量垂至于背后的橫線劃痕， 槍頭要垂直，不能傾斜；(4)用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基；一般按0、24、48、72h取樣，在顯微鏡下拍照，并且保證在不同時間點下， 拍下相同視野的照片。4、注意事項1)劃痕前不需要吸干培養(yǎng)基，劃痕結(jié)束后再吸掉培養(yǎng)基加PBS清洗后加無血清2)劃痕的距離不宜太寬，以免不能在顯微鏡視野下呈現(xiàn)；3)若劃痕實驗過程中需藥物作用，其藥物濃度需在無血清條件下進行摸索。4)若在相應(yīng)時間點拍照時發(fā)現(xiàn)漂浮的細胞過多，此時需更換培養(yǎng)

12、基，洗干凈漂 浮的細胞后再繼續(xù)拍照。5)劃痕法一般只能用于上皮，纖維樣細胞系。因為a.這些細胞本身有遷移能力，且較強。b.細胞有極性，方便測量，觀察。c.細胞對無血清有較強的忍受力(至少 24小時)，因此很多月中瘤細胞系是不適合 做劃痕的，很多月中瘤細胞系在無血清培養(yǎng)下，12小時細胞凋亡就超過50%。而一些上皮樣細胞系甚至可以忍受高達 72小時的無血清實驗?？寺⌒纬蓪嶒灢僮髁鞒?、實驗原理:克隆形成實驗是月中瘤細胞學(xué)研究中的一種常用技術(shù)，其原理是將細胞分離成單細胞懸液，在培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)，根據(jù)集落形成數(shù)量和大小來檢測細胞增殖 能力和致瘤性。該實驗可用來研究月中瘤細胞的增殖能力、侵襲性，探討細胞

13、對不 同殺傷因素的敏感性。根據(jù)培養(yǎng)基是否需要軟瓊脂，克隆形成實驗可以分為平板克隆形成實驗（PCF和軟瓊脂克Pi形成實驗（SACF。 PC支直接將細胞接種于培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿中，優(yōu)點為操作簡便、細胞間分泌的促生長因子可在培養(yǎng)液中擴散、克隆形成率高，適用于貼壁生長的細胞；缺點為細胞在貼壁前易于移動。SACF是采用 半固體培養(yǎng)基模擬體內(nèi)生長環(huán)境，適用于懸浮細胞及不依賴于貼壁生長的月中瘤細 胞。在懸浮狀態(tài)下不能增殖的細胞（如正常成纖維細胞）不適用此法。2、實驗材料與儀器：試劑培養(yǎng)基： Corning 公司；雙抗（青霉素、鏈霉素）：Gibco公司；胰酶：0.5%Trypsin-EDTA, Gibco 公司。

14、儀器生物安全柜：離心機：倒置顯微鏡：c恒溫培養(yǎng)箱：3、實驗方法:實驗流程細胞前處理克隆形成結(jié)果分析實驗步驟（1）適用細胞：貼壁細胞（2）將目的細胞的培養(yǎng)基吸棄，用1BS潤洗2遍去除殘余的培養(yǎng)基，加入 胰酶消化細胞（最好將細胞消化成單個細胞或者后續(xù)吹打細胞使其成單個 細胞狀態(tài)）。細胞離心棄去上清，用適量培養(yǎng)基重懸，使用細胞計數(shù)板計 數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果將細胞密度稀釋（最好梯度稀釋）成合適的密度（如 10000個/ml）;（3）細胞鋪板：若要觀察正常細胞的克隆形成情況，建議按六孔板每孔300-500 個鋪板，14-20天后結(jié)束培養(yǎng)；若要看藥物處理或輻射等處理的細胞集落 形成情況，建議做個預(yù)實驗，六孔板

15、分別鋪 500, 2000, 4000, 8000,個 /孔，14-20天后結(jié)束培養(yǎng)，找出最適的密度，然后再進行后續(xù)的實驗； （4） 14-20天后，細胞停止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)基，用 1XPBS洗3遍，然后 用4%PFA固定液固定30分鐘，1XPBS洗3遍，然后加入0.1%結(jié)晶紫染 色30分鐘，再用1XPBS洗3遍至五紫色背景，最后在鏡下數(shù)細胞集落數(shù)。4、注意事項1）細胞培養(yǎng)過程較長前期3-4天換一次培養(yǎng)基，后期2-3天換一次培養(yǎng) 基，可觀察培養(yǎng)基顏色來保證細胞營養(yǎng)充足。2）細胞停止培養(yǎng)前先在顯微鏡下觀察其形成集落情況，以看到大部分集 落由50個以上單個細胞組成為宜。3）用PBS青洗結(jié)晶紫染液時應(yīng)

16、盡快吸掉，不可在PBS中浸泡時間過長，以 免褪色。細胞凋亡檢測操作流程1、實驗原理:在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在 細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V 是一種分子量為3536kD的Ca2膿賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度 親和力，故可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將 Annexin V進行熒光 素（EGFP FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡 或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化

17、丙呢（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細 胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞， PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。 因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。2、實驗材料與儀器:試劑Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection kits :聯(lián)科生物流式胰酶：Gibco公司，流式管。儀器流式細胞儀：3、實驗方法:實驗流程瑁胞培養(yǎng)及處理和記譏體等）流式數(shù)據(jù)分析瑁胞培養(yǎng)及處理和記譏體等）流式數(shù)據(jù)分析1不帶GFP熒光細胞凋亡實驗步驟(Annexin V-FITC/PI )(1)收集細胞：貼壁細

18、胞：收集細胞上清，用1XPBS清洗兩次，0.25%流式胰酶(不含EDTA)消化細胞，輕輕吹打，收集細胞，500Xg常溫離心5-10min；懸浮細胞：輕柔吹打，收集細胞，500次常溫離心5-10min；(2)用1XPBS (4C預(yù)冷)清洗兩次，500g,離心5-10min收集細胞；(3)用1XBinding Buffer (ddH2。稀釋)重懸細胞，調(diào)整細胞密度為 3-5漢05個 /ml ；(4)轉(zhuǎn)移300 L上述細胞懸液至流式管；(5)每管細胞中加入5 L的Annexin V-FITC混勻后室溫避光孵育15min,之后 再加入5人的PI混勻后，室溫避光孵育5min；(6)最后補加200的1XB

19、inding Buffer,轉(zhuǎn)移至流式管上機檢測；(7)選擇熒光通道FITC和PE通道，檢測細胞量在所圈定的細胞群一般收集1 X04個細胞。3.3帶GFP熒光細胞凋亡實驗步驟(Annexin V-APC/7-AAD )儀器參數(shù)調(diào)節(jié)(1)收集1X106-3漢06個細胞，用預(yù)冷PBS清洗兩次，500包，離心5-10min收 集細胞；(2)加入 500ul Apoptosis Positive Control Solution 重懸，置冰上孵育 30min；(3)用預(yù)冷PBS洗滌，500包，離心5-10min收集細胞；(4)加入預(yù)冷1XBinding Buffer重懸，并加入數(shù)量相同且未經(jīng)處理的活細

20、胞與之混合。加入預(yù)冷1XBinding Buffer補充至1.5ml,等分為三管，其中一管 為空白對照組，兩管為單染管；(5)流式上機，用單染管調(diào)節(jié)熒光通道的補償。3.2樣本檢測(1)按照實驗方案誘導(dǎo)凋亡；(2)收集細胞：貼壁細胞：收集細胞上清，用1XPBS清洗兩次，0.25%流式胰酶(不含EDTA)消化細胞，輕輕吹打，收集細胞，500Xg常溫離心5-10min；懸浮細胞：輕柔吹打，收集細胞，500次常溫離心5-10min。(3)用1XPBS (4C預(yù)冷)清洗兩次，500%，離心5-10min收集細胞；(4)用1XBinding Buffer (ddH2O稀釋)重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1M06

21、-1 M07 個/ml ；(5)轉(zhuǎn)移100人上述細胞懸液至流式管，約1X105-1 X06個/管；(6)每管細胞中加入5 L的Annexin V-APC和10ul7-ADD ,輕柔渦旋混勻后室 溫避光孵育15min；(7)最后補加300的1XBinding Buffer,轉(zhuǎn)移至流式管上機檢測；(8)選擇熒光通道APC和PerCP通道，檢測細胞量在所圈定的細胞群一般收集1 X04個細胞。4、注意事項1)每管細胞量一般是1X05個；2)凋亡實驗必須收集含有凋亡細胞的細胞上清，不可棄用；3)細胞消化和清洗過程中動作輕柔，減少細胞碎片；4)貼壁細胞消化，用不含 EDTA胰酶消化，以免 EDTA與Ca2

22、+鰲合，影響 Annexin V 結(jié)合；5)需要有兩個單染樣本，用于調(diào)節(jié)通道的熒光補償；6)實驗過程中，工作液及熒光染料需置于冰上。但是染色需在室溫進行；7)加完染料處理后必須在1h內(nèi)進行流式上機檢測；8)流式圖舉例幽 Tube_052.fcs; Ungat. Tube_052.fcs; Lymp.Fi e Edit Graph Display Go HelpFi e Edit Graph Disol ay Go HelpfiTFlYla o 區(qū)9F3C-A T|OptionsAb Acove 3ate - 93.1 ymphocytes公E 55喃 Coimt 15000/15000 10t

23、S公 (J LympnocytcsWarring 90% of events are cntre c，jrt edges! 甲2可 Comp-FITC-A: FITC-A 畫m細胞周期檢測操作流程1、實驗原理：由于細胞周期各時相的DN蛤量不同，因此，可通過特異性與DN匐合染料 來檢測細胞內(nèi)的DN給量來測定細胞周期。流式中常用碘化丙噬（Propidium ,簡 稱PI）與DNAg合，其熒光強度與DN總量成正比。因此，通過流式細胞儀對細 胞內(nèi)DN蛤量進行檢測，同時獲得的流式直方圖對應(yīng)的各細胞周期可通過特殊軟 件計算各時相的細胞百分率。2、實驗材料與儀器：試劑無水乙醇：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；Cell Cycle Staining Kit:聯(lián)科生物;流式胰酶：Gibco Company。流式管。儀器流式細胞儀：3、實驗方法:實驗流程實驗步驟細胞處理前需進行同步化處理，一般用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,也可用秋水仙素進行預(yù)處理。(1)收集細胞(細胞量2M05-1 X06)貼壁細胞：收集細胞上清，用1XPBS清洗兩次，0.25%流式胰酶消化細 胞，輕輕吹打，收集細胞，500區(qū)常溫離心5-10min；懸浮細胞：輕柔吹打，收集細胞，500區(qū)常溫離心5-