普通生物學(xué)公開課一等獎(jiǎng)優(yōu)質(zhì)課大賽微課獲獎(jiǎng)?wù)n件

1、DNA復(fù)制1第1頁# DNA復(fù)制過程1，促旋酶和解旋酶在復(fù)制起點(diǎn) 打開雙螺旋。2，單鏈結(jié)合蛋白與解開單鏈結(jié)合，預(yù)防單鏈重新聚合為雙鏈。3，引發(fā)酶在前導(dǎo)鏈和后隨鏈上合成10bp左右RNA引物。2第2頁4，DNA聚合酶III在引物3末端添加堿基，完成鏈延伸。5，DNA聚合酶I移除掉RNA引物，同時(shí)補(bǔ)平RNA引物3與新合成鏈缺口。6，DNA連接酶補(bǔ)平后隨鏈上RNA引物5端與新合成鏈切口。3第3頁# Okazaki fragment (岡崎片段) 1968 Reiji Okazaki岡崎片段，相對(duì)比較短DNA鏈（大約1000核苷酸殘基），是在DNA 后隨鏈不連續(xù)合成期間生成片段。4第4頁DNA半保留復(fù)

2、制在DNA復(fù)制過程中，每條單鏈都能指導(dǎo)一條互補(bǔ)鏈合成形成兩個(gè)子DNA雙鏈。因?yàn)槊總€(gè)子DNA雙鏈中一條來自親本，另一條是新合成核苷酸鏈，所以，該復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。5第5頁DNA polymerase III6第6頁DNA復(fù)制（動(dòng)畫）滑動(dòng)夾子DNA解旋酶DNA引物酶DNA聚合酶DNA聚合酶HDNA連接酶7第7頁UUUACCATTCCCCAAGGGGGUTTTTGCCCCCAAAAAATTTTTTGGGGGGTGTGGGTCCCCAAATGTTCCCAAATGTGGGTCCCCAAATGTTCCCAAATGTGGGTCCCCAAAGCCCCCAAAAAATTTTTTGGGGGGUUUUUUUU

3、UUUUUUUDNA解旋酶打開DNA雙鏈引物酶合成引物（RNA），為復(fù)制準(zhǔn)備8第8頁UUUACCATTCCCCAAGGGGGUTTTTGCCCCCAAAAAATTTTTTGGGGGGTGTGGGTCCCCAAATGTTCCCAAATGTGGGTCCCCAAAUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGGGCCCCCTGTTCCCAAATGTGGGTCCCCAAAGCCCCCAAAAAATTTTTTGGGGGG先導(dǎo)鏈后隨鏈9第9頁UUUACCATTCCCCAAGGGGGUTTTTGCCCCCAAAAAATTTTTTGGGGGGTGTTCCCAAATGTGGGTCCCCAAAUUUUUUUUU

4、UUUUUUUTTGGGGGGGGCCCCCGGGGGGGCCCCCCCCAAAAAAAAAAATTTTTAAAAAAAGGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTGCCCCCAAAAAATTTTTTGGGGGGTGTTCCCAAATGTGGGTCCCCAAA先導(dǎo)鏈后隨鏈DNA聚合酶合成DNA片段10第10頁UUUACCATTCCAAGGGGGUTTTGCCCCCAAAAAATTTTTTGGGGGGTGTTCCCAAATGTGGGTCCCCAAAUUUUUUUUUUUUUUTTGGGGGGGCCCCCGGGGGGGCCCCCCCCAAAAAAAAAAATTTTTAAAAGGGGGGGGGGGG

5、GGGTTTTTGCCCCCAAAAAATTTTTTGGGGGGAAAAAAAACCCCCCCUUGCTAAAGG后隨鏈先導(dǎo)鏈后隨鏈繼續(xù)合成新引物，然后合成新片段岡崎片段TGTTCCCAAATGTGGGTCCCCAAA11第11頁UUUACCATTCCAAGGGGGUTTTGCCCCCAAAAAATTTTTTGGGGGGTGTTCCCAAATGTGGGTCCCCAAAUUUUUUUUUUUUUUTTGGGGGGGCCCCCGGGGGGGCCCCCCCCAAAAAAAAAAATTTTTAAAAGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTGCCCCCAAAAAATTTTTTGGGGGGAAAAAAAA

6、CCCCCCCUUGCTAAAGGTGTTCCCAAATGTGGGTCCCCAAADNA聚合酶H切除引物片段，并填補(bǔ)缺口，留下一個(gè)小缺口（紅色區(qū)域）12第12頁UUUACCATTCCAAGGGGGUTTTGCCCCCAAAAAATTTTTTGGGGGGTGTTCCCAAATGTGGGTCCCCAAAUUUUUUUUUUUUUUTTGGGGGGGCCCCCGGGGGGGCCCCCCCCAAAAAAAAAAATTTTTAAAAGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTGCCCCCAAAAAATTTTTTGGGGGGAAAAAAAACCCCCCCUUGCTAAAGGTGTTCCCAAATGTGGGTC

7、CCCAAADNA連接酶填補(bǔ)小缺口13第13頁UUUACCATTCCAAGGGGGUTTTGCCCCCAAAAAATTTTTTGGGGGGTGTTCCCAAATGTGGGTCCCCAAAUUUUUUUUUUUUUUTTGGGGGGGCCCCCGGGGGGGCCCCCCCCAAAAAAAAAAATTTTTAAAAGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTGCCCCCAAAAAATTTTTTGGGGGGAAAAAAAACCCCCCCUUGCTAAAGGTGTTCCCAAATGTGGGTCCCCAAA解旋酶脫下，DNA復(fù)制完成14第14頁 端粒酶(telomerase)細(xì)胞中負(fù)責(zé)端粒延長(zhǎng)一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶1

8、5第15頁Telomerase activity細(xì)胞每分裂一次端粒閾值細(xì)胞停頓分裂, 生物開始衰落和死亡When telomerase activity is repressed直接決定了端粒是否會(huì)縮短腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性是高還是低呢？成熟細(xì)胞中端粒酶活性會(huì)伴隨年紀(jì)增加而減弱!16第16頁 RNA轉(zhuǎn)錄 (RNA transcription) 17第17頁 1，RNA 化學(xué)結(jié)構(gòu)RNA /DNA StructureRNA含有四種基本堿基，即腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶(U)。18第18頁RNA與DNA區(qū)分RNA堿基組成與DNA不一樣，RNA沒有堿基T（胸腺嘧啶），而有堿基U（尿嘧啶）。RNA只有

9、一條鏈，在許多區(qū)段可發(fā)生本身回折，使部分A-U、G-C堿基配對(duì)，從而形成短不規(guī)則螺旋區(qū)。不配正確堿基區(qū)膨出形成環(huán)，被排斥在雙螺旋之外。19第19頁#基因表示：DNA RNAProtein解螺旋轉(zhuǎn)錄去掉內(nèi)含子合成蛋白質(zhì)20第20頁在RNA聚合酶催化下，以一段DNA鏈為模板合成RNA，從而將DNA所攜帶遺傳信息傳遞給RNA過程稱為轉(zhuǎn)錄（transcription）。經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成RNA有各種，主要是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA(small nuclear RNA和HnRNA等。DNA 轉(zhuǎn)錄RNA轉(zhuǎn)錄：DNA模板指導(dǎo)下RNA合成21第21頁復(fù)制和轉(zhuǎn)錄區(qū)分 22第22頁轉(zhuǎn)錄是以 DNA為模板合

10、成RNA, 而且只是以單股DNA 為模板，所以含有不對(duì)稱性；用以轉(zhuǎn)錄單鏈DNA, 稱為模板鏈, 與復(fù)制不一樣，轉(zhuǎn)錄是局部,從開啟子開始到終止子結(jié)束,為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位;轉(zhuǎn)錄不需要引物；轉(zhuǎn)錄忠實(shí)性相對(duì)弱；轉(zhuǎn)錄首先得到RNA前體，然后再進(jìn)行加工轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霷NA.轉(zhuǎn)錄特點(diǎn) 23第23頁 轉(zhuǎn)錄（transcription）不對(duì)稱性就是指以雙鏈DNA中一條鏈作為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而將遺傳信息由DNA傳遞給RNA。對(duì)于不一樣基因來說，其轉(zhuǎn)錄信息能夠存在于兩條不一樣DNA鏈上。轉(zhuǎn)錄不對(duì)稱性24第24頁能夠轉(zhuǎn)錄RNA那條DNA鏈稱為模板鏈(template strand) ，也稱作反義鏈。 與模板鏈互補(bǔ)另一條DNA

11、鏈稱為編碼鏈(coding strand)，也稱為有意義鏈。 模板鏈編碼鏈55335525第25頁5GCAGTACATGTC 33CGTGATGTACAG 5編碼鏈模板鏈mRNA5GCAGUACAUGUC 3轉(zhuǎn)錄NAla Val His Val C蛋白質(zhì)翻譯模板鏈、編碼鏈與轉(zhuǎn)錄及翻譯關(guān)系26第26頁Sense strand and antisense strand35new RNA strand3535template strand*coding strand*GTACGUACCATGnegative strandantisense strandpositive strandsense str

12、andWatson strandCrick strand27第27頁RNA轉(zhuǎn)錄合成時(shí)，只能向一個(gè)方向進(jìn)行聚合，所依賴模板DNA鏈方向?yàn)?5，而RNA鏈合成方向?yàn)?3。 轉(zhuǎn)錄單向性28第28頁RNA轉(zhuǎn)錄合成時(shí)，以DNA作為模板，在RNA聚合酶催化下，連續(xù)合成一段RNA鏈，各條RNA鏈之間無需再進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)錄連續(xù)性29第29頁RNA轉(zhuǎn)錄合成時(shí)，只能以DNA分子中某一段作為模板，故存在特定起始位點(diǎn)和特定終止位點(diǎn)。特定起始點(diǎn)和特定終止點(diǎn)之間DNA鏈組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，通常由轉(zhuǎn)錄區(qū)和相關(guān)調(diào)整次序組成。 有特定起始和終止位點(diǎn)30第30頁#基因表示需要開啟子(Promoter)RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合DN

13、A序列。開啟子（Promoters）就像“開關(guān)”，決定基因活動(dòng)。31第31頁P(yáng)romoter 開啟子 is a region of DNA where RNA polymerase binds to initiate transcription.Startpoint (起始位點(diǎn)) refers to the position on DNA corresponding to the first base incorporated into RNA.Terminator （終止子） is a sequence of DNA that causes RNA polymerase to termina

14、te transcription.Transcription unit（轉(zhuǎn)錄單位） is the distance between sites of initiation and termination by RNA polymerase. 轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵部件32第32頁Upstream （上游） identifies sequences proceeding in the opposite direction from expression.Downstream （下游）identifies sequences proceeding farther in the direction of expr

15、ession.33第33頁原核生物轉(zhuǎn)錄34第34頁原核生物中RNA聚合酶全酶由五個(gè)亞基組成，即2。亞基與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)識(shí)別相關(guān)，在轉(zhuǎn)錄合成開始后被釋放；余下部分（2）被稱為關(guān)鍵酶，與RNA鏈聚合相關(guān)。 原核生物RNA聚合酶關(guān)鍵酶 (core enzyme) 全酶 (holoenzyme)35第35頁原核生物RNA聚合酶亞基功效36第36頁RNA聚合酶開始結(jié)合到基因上游序列 開啟子 promoter 決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)Promoter short nucleotide sequence recognized by RNA polymerase 由RNA聚合酶識(shí)別短DNA序列All promoters

16、in E. coli have similar sequence (all recognized by same polymerase)Transcription Initiation 轉(zhuǎn)錄37第37頁原核生物轉(zhuǎn)錄起始區(qū)一致性序列 -35 box 5-TTGACA-3 (Sextama box)-10 box 5-TATAAT-3 (Pribnow box) 38第38頁大腸桿菌開啟子共有序列功效AGTCTTGACAAATTTAAATAACTGTAATPribnow框-10-35識(shí)別區(qū)16-19bp5-9bp起點(diǎn)被RNA聚合酶識(shí)別區(qū)段就是位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)-35區(qū)TTGACA序列。RNA聚合酶與該

17、區(qū)結(jié)合后，即滑動(dòng)至-10區(qū)TATAAT序列（Pribnow盒），并開啟轉(zhuǎn)錄。 39第39頁The subunit of RNA polymerase recognizes promoter.40第40頁Closed complex (全酶與DNA結(jié)合)RNA聚合酶與DNA結(jié)合DNA 保持雙鏈.41第41頁The DNA strand separate over a distance of 14 bp (-11 to +3 ) around the start site (+1 site)DNA雙鏈在起始位點(diǎn)附近打開Open complex42第42頁 DNA局部雙鏈解開。 RNA聚合酶全酶(2

18、)與模板（開啟子區(qū)）結(jié)合。 在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。產(chǎn)生第一個(gè)核苷酸(+1)轉(zhuǎn)錄起始過程：43第43頁RNA合成起始 RNA聚合酶全酶+開啟子DNA處于雙鏈狀態(tài)聚合酶全酶所結(jié)合DNA序列中有一小段雙鏈被解開RNA聚合酶、DNA和新生RNA44第44頁Transcription Elongation 轉(zhuǎn)錄延伸45第45頁Transcription bubbleThe length of the bubble is 12-14 bp, and the length of RNA-DNA hybrid within it is 8-9 bp.46第46頁轉(zhuǎn)錄空泡(

19、transcription bubble)形成47第47頁因子從全酶上脫離，余下關(guān)鍵酶繼續(xù)沿DNA鏈移動(dòng)，按照堿基互補(bǔ)標(biāo)準(zhǔn)，不停聚合RNA。 1. 亞基脫落，RNApol聚合酶關(guān)鍵酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；2. 在關(guān)鍵酶作用下，NTP不停聚合，RNA鏈不停延長(zhǎng)。轉(zhuǎn)錄延伸48第48頁 factor can be reused49第49頁What is the sign of Transcription termination ?RNA聚合酶離開DNA雙鏈50第50頁RNA轉(zhuǎn)錄合成終止機(jī)制有兩種：1，內(nèi)在因子，非Rho因終止子：轉(zhuǎn)錄終止特殊信號(hào)（一段RNA 序列） 2依賴Rho因

20、子轉(zhuǎn)錄終止：由終止因子（因子）識(shí)別特異終止信號(hào)，并促使RNA釋放。轉(zhuǎn)錄終止：RNA 聚合酶停滯， RNA 解離51第51頁模板DNA鏈在靠近轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)處存在相連富含GC和AT區(qū)域，使RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成寡聚U及發(fā)夾形二級(jí)結(jié)構(gòu)，引發(fā)RNA聚合酶變構(gòu)及移動(dòng)停頓，造成RNA轉(zhuǎn)錄終止。1非依賴Rho轉(zhuǎn)錄終止：52第52頁b) Function G/C rich transcription delay Hairpin loop RNApol pausing polyA/U RNApol leave 53第53頁Weakest base pairing: A:U make the dissociation

21、easier不依賴于因子終止子 (內(nèi)在終止子 ) 54第54頁大腸桿菌兩類終止子回文結(jié)構(gòu)A. 不依賴于Rho（）終止子A. 依賴于Rho（）終止子富含G-C系列U55第55頁ATP2，依賴 Rho因子轉(zhuǎn)錄終止DNA 序列缺乏共性，不能形成強(qiáng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)6聚體， 含有NTP酶和解螺旋酶56第56頁提純RNA聚合酶并不能識(shí)別特異性轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，而加入大腸桿菌因子后該聚合酶就能在DNA模板上準(zhǔn)確地終止轉(zhuǎn)錄。只含有自我互補(bǔ)區(qū)域，可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，但在莖中G.C含量少，莖環(huán)易打開。其終止需要 因子參加。 因子與ssRNA特定位點(diǎn)結(jié)合(C豐富，G缺乏 )。經(jīng)過催化NTP水解促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離

22、。57第57頁結(jié)合到RNA鏈終止子上游某一點(diǎn) 因子結(jié)合以后延著RNA向3端移動(dòng)，跟蹤聚合酶 追上在終止位點(diǎn)暫停RNA 聚合酶終止-三元復(fù)合物解體因子參加RNA合成終止模式“窮追”（hot pursuit）模型 58第58頁原核轉(zhuǎn)錄和翻譯同時(shí)進(jìn)行59第59頁60第60頁真核生物中RNA聚合酶可按其對(duì)-鵝膏蕈堿敏感性而分為三種，它們均由1012個(gè)大小不一樣亞基所組成，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，其功效也不一樣。 真核生物三種RNA聚合酶酶位置產(chǎn)物活性比較對(duì)-鵝膏蕈堿敏感性RNA聚合酶核仁5.8S, 18S, 28S rRNA50-70%不敏感RNA聚合酶核漿不均一核RNA(heterogeneous nucle

23、ar RNA,hnRNA)20-40%敏感RNA聚合酶核漿tRNA/5S rRNA小RNA10%有種屬特異性Transcription of Eukaryotes 真核生物轉(zhuǎn)錄61第61頁3類RNA聚合酶；真核生物RNA聚合酶結(jié)構(gòu)比大腸桿菌RNA聚合酶復(fù)雜；在細(xì)胞核中位置不一樣；負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄基因不一樣，對(duì)-鵝膏蕈堿敏感性也不一樣。真核生物RNA聚合酶普通有8-14個(gè)亞基所組成，相對(duì)分子質(zhì)量超出5105。62第62頁真核生物中RNApol作用必須有其它相關(guān)轉(zhuǎn)錄蛋白在開啟子位置先期結(jié)合才能開啟轉(zhuǎn)錄.這類是起正調(diào)控作用反式作用因子，即為轉(zhuǎn)錄因子。真核轉(zhuǎn)錄起始需要各種轉(zhuǎn)錄因子（TF）63第63頁真核生物R

24、NA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子及其功效64第64頁真核生物轉(zhuǎn)錄過程1. 轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段：Upstream activating sequence，UAS（上游激活序列）真核生物轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-35-25bp區(qū)也存在一段富含TA次序，被稱為Hogness盒或TATA盒，通常認(rèn)為是開啟子關(guān)鍵序列。（一）轉(zhuǎn)錄起始： 真核生物開啟子65第65頁TATA Box （ TATA元件）1) Similar to the prokaryotic Pribnow box, it locates at 25-35 bp upstream of initiation site, the consensus sequence

25、is TATA(A/T)A. 2) TATA box makes transcription initiation occur precisely at specific site. TATA框能夠使RNA聚合酶在固定位點(diǎn)準(zhǔn)確起始轉(zhuǎn)錄。TATA框發(fā)生點(diǎn)突變將使轉(zhuǎn)錄水平下降，同時(shí)所取得RNA產(chǎn)物起始點(diǎn)不固定。66第66頁除此之外，在真核生物中還可見到其它帶共性序列，如 -80-70, CAAT盒(ccaat)及-110-80GC盒(gggcggg)等。 TATA盒上游序列：UAS,在遠(yuǎn)離受控基因處存在，能夠增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控序列稱為增強(qiáng)子（enhancer）。增強(qiáng)子特點(diǎn)： 遠(yuǎn)距離效應(yīng)；無方向性

26、；順式調(diào)控；廣泛性，相位性67第67頁增強(qiáng)子(enhancer)作用方式和特點(diǎn) -Enhancer complex與近開啟子general transcriptional complex構(gòu)型契合，而不與RNA polymerase 結(jié)合 - 特化細(xì)胞內(nèi)，具全部特異激活蛋白（trans-factor）才能表現(xiàn)出增強(qiáng)效應(yīng)，即增強(qiáng)子組織特異性 - 增強(qiáng)子復(fù)合體，以正控制方式調(diào)整基因表示。68第68頁69第69頁增強(qiáng)子(enhancer) 與promoter區(qū)分 #能強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄效率一段DNA序列為增強(qiáng)子。Enhance expression Basic expressionPosition not be

27、 fixed isolated region Bi-directional element Mono-directional element Enhancer PromoterNo for special gene only for special gene Enhancer與Promoter比較70第70頁真核生物開啟子保守序列參加轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)確定起始控制轉(zhuǎn)錄起始頻率71第71頁真核生物轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，首先由TFDTBP亞基識(shí)別并結(jié)合TATA盒，然后在其它轉(zhuǎn)錄因子配合下，與RNA聚合酶組裝形成轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(pre-initiation complex, PIC)。2. 轉(zhuǎn)錄起始過程：72第72頁

28、 -RNApol II + 20TFs 逐層組裝 TIC 轉(zhuǎn)錄開啟 (Transcriptional Initiation Complex)73第73頁RNA聚合酶催化第一個(gè)磷酸二酯鍵形成。RNA聚合酶羧基末端結(jié)構(gòu)域（CTD）被磷酸化修飾，大部分轉(zhuǎn)錄因子脫離，聚合酶向下游移動(dòng)延伸RNA鏈。74第74頁3) The C-terminus of the largest subunit of RNA polymerase II contains a number of heptapeptide repeats, named carboxyl terminus domain (CTD). RNA聚合酶

29、II最大亞基C端，含有由若干個(gè)七肽Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser-重復(fù)次序組成C端結(jié)構(gòu)域。C-terminal domain (CTD) is critical for transcriptional initiation, and is phosphorylated during transcription in vivoAntibody staining of polytene chromosome: red - phosphorylated RNA pol II CTD, green - unphosphorylated RNA pol II CTD. Red is at puffs where transcription is active.75第75頁（二）轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程與原核生物類似，但因?yàn)榇嬖诤诵◇w高級(jí)結(jié)構(gòu)，故在轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程中可觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。76第76頁（三）轉(zhuǎn)錄終止真核生物轉(zhuǎn)錄終止與轉(zhuǎn)錄后修飾，即poly A尾巴結(jié)構(gòu)添加親密相關(guān)。在poly A修飾位點(diǎn)下游存在一組共同序列AATAAA和GTGTGT，為轉(zhuǎn)錄終止識(shí)別修飾位點(diǎn)。在轉(zhuǎn)錄越過修飾點(diǎn)后，RNA鏈在修飾點(diǎn)處被切斷，隨即進(jìn)行加帽和加尾修飾。77第77頁真核生物RNA轉(zhuǎn)錄終止5-AAUAAA-5 -AAUAAA-核酸酶-GUGUGUGRNA-polAA