質(zhì)粒dna提取方法與原理

1、質(zhì)粒提取的原理、操作步驟、各溶液的作用從 至 以質(zhì)粒提取的原理、操作步驟、各溶液的作用從 至 以主上，隨粒 分DNA 相中常用 8.0）10ml，葡萄糖4.730gddH2O500ml。在10lbf/in215min分子生物學(xué)試劑中的主要DNase微生物生長。在溶液I加入高10mMEDTA，無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不EDTA，其實(shí)也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話告訴你， 只要用等體積的水，或 LB 培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。 恢 性2. 溶液：0.2NNaOH，1SDS。2NNaOH1ml，10%SDS1ml，加

2、ddH2O10ml。使用前臨時配置 這是用新鮮的0.4 NNaOH2的SDS等體積混合后使用的。要新從NaOH稀0.4NNaOH，無非是為了膜發(fā)生了從 bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的 0.4NNaOH，即便是有用 當(dāng)粒，因SDS是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對NaOH作用誤以為是為了沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA性復(fù)的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問，既然是NaOH解的細(xì)胞，那為什么要加呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時間不能過長，千 萬不要這時候去組 3.溶液：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH4.8。5MKAc300ml，冰

3、醋酸57.5ml，加ddH2O500ml。4沉淀。如果你這樣懷疑，往 1%的 SDS 溶液中加如 2M 的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與 來的蛋白質(zhì)。既然SDS是遇酸發(fā)生的沉淀，那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1的SDS液中慢慢加5NNaCl，你現(xiàn)沉淀的量 要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀, 那么2M醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因?yàn)殚L時那么2M醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因?yàn)殚L時間的堿性條件會DNA，所以要中和之組 關(guān)系。溶液 III 加入并混合均勻后在冰上放置

4、，目的是為了PDS 沉淀更充分一點(diǎn)。4.TE：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)。1MTris-HCl（pH8.0）1ml，0.5MEDTA（pH8.0）0.2ml，加5.苯酚/氯仿 /異戊醇（25：24：1）為 沉的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個全面的介紹。酚（Phenol）對蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，按道理應(yīng)略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（4M），離心有一點(diǎn)，酚與水很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。至于戊醇的

5、添加，其作 沉?xí)?導(dǎo)致RNaseA（RNAA）：不含DNADNase-free)RNaseA10mg/ml，TE加熱15min . 中，勿使有氣泡，靜置冷卻 30min 以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液 0.5TBE），即可上 樣。溫離心 為裂解液，故離心管中菌液逐漸變 清）。DNA 任何化學(xué)反應(yīng)，對 DNA 很安全，因此是理想的沉淀劑。DNADNA定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪DNADNA失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀 DNA 時可用 95乙醇代替無水乙酵，最后在 pH8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度NaAcNaClNa+中和 DNA子上的負(fù)電荷，減少 中9.淀溶