動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)

1、實(shí)驗(yàn)一 動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)1一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)菌操作技術(shù)。2. 掌握動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)的基本方法。2二、實(shí)驗(yàn)原理 原代培養(yǎng)( primary culture )是指取自體內(nèi)的新鮮組織、細(xì)胞，在體外條件下生長(zhǎng)至傳代之前細(xì)胞培養(yǎng)階段，是細(xì)胞培養(yǎng)的最初和必經(jīng)階段。原代培養(yǎng)方法主要有組織塊貼壁培養(yǎng)法和分散細(xì)胞培養(yǎng)法。組織塊貼壁培養(yǎng)法是將切成小塊的組織貼附在適宜的支持物上，細(xì)胞從組織塊邊緣游離、生長(zhǎng)，形成單層細(xì)胞即為原代培養(yǎng)細(xì)胞。分散細(xì)胞培養(yǎng)法是通過(guò)酶消化或機(jī)械分離，使組織分散成單個(gè)細(xì)胞，然后開(kāi)始首次培養(yǎng)的方法。3三、實(shí)驗(yàn)材料 1動(dòng)物材料 出生2周內(nèi)的大鼠。2實(shí)驗(yàn)試劑 （1）D-Hanks

2、 液（2）75%乙醇（3）0.05% 型膠原酶液（4）DMEM培養(yǎng)基（5）小牛血清（6）雙抗溶液（7）0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液43實(shí)驗(yàn)器材超凈工作臺(tái)、倒置相差顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、水浴鍋、離心機(jī)、眼科剪、眼科鑷、移液器及槍頭、培養(yǎng)皿、燒杯、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、吸管、離心管、血球計(jì)數(shù)板、載玻片、蓋玻片、200目不銹鋼篩網(wǎng)、酒精燈、75酒精棉球、記號(hào)筆等。5四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 1取1只大鼠，頸椎脫臼法處死，浸入75%乙醇消毒。2. 將小鼠置于超凈臺(tái)中的大培養(yǎng)皿中，背部朝上，用75%酒精棉球擦拭其整個(gè)背部皮膚。3用眼科鑷提起小鼠腰部皮膚，用眼科剪橫向剪開(kāi)皮膚，稍用力將剪開(kāi)的皮膚拉向兩端，暴露腰部。更換解剖器械，剪

3、開(kāi)腰部的肌肉、被膜，取出腎臟，置于培養(yǎng)皿中。4. 更換解剖器械，去除腎被膜，去除腎盂，用含有雙抗的D-Hanks液清洗3次，剪取腎皮質(zhì)部分，移入小燒杯中，加入少量D-Hanks液，剪成1mm3左右的組織塊。用D-Hanks液清洗3次，吸去上清液，盡量去除血細(xì)胞。65向組織塊中加入0.05% 型膠原酶消化液，37水浴振蕩消化5分鐘后，用吸管吹打數(shù)次，吸取上清于離心管中，4冰箱保存，向剩余組織塊中添加膠原酶消化液，繼續(xù)37水浴振蕩消化，每隔5分鐘，用吸管反復(fù)吹打，收集上清液，直至組織塊完全消化。全部上清液在4、800rpm 條件下離心5分鐘，棄去上清液，向沉淀中加入培養(yǎng)液，吹打成懸液。6. 用20

4、0目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，去除較大組織塊，濾液在4、500rpm 條件下離心5分鐘，棄去上清液。向沉淀中加入3mL含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞。7用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及其存活率，將細(xì)胞以（35）105個(gè)/mL密度接種于25mL培養(yǎng)瓶中，每瓶加入細(xì)胞懸液3mL。在培養(yǎng)瓶上標(biāo)注組織來(lái)源、實(shí)驗(yàn)者姓名和實(shí)驗(yàn)日期。將培養(yǎng)瓶移入37的5% CO2培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)。8. 逐日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。2天后進(jìn)行換液，去除懸浮在培養(yǎng)液中的無(wú)活性細(xì)胞。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。7五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 分離細(xì)胞培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞12小時(shí)貼壁，24小時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞從小細(xì)胞團(tuán)周邊生長(zhǎng)，23天可長(zhǎng)成單層，細(xì)胞呈扁

5、平不規(guī)則多邊形，鵝卵石樣排列。8六、注意事項(xiàng)1原代培養(yǎng)過(guò)程中所使用的解剖器械、培養(yǎng)基、溶液、器皿等要經(jīng)過(guò)高壓滅菌或過(guò)濾除菌后方可使用。2解剖動(dòng)物和取材的各個(gè)步驟應(yīng)更換解剖器械，以免細(xì)胞被污染。3. 在CO2培養(yǎng)箱中，若選用的培養(yǎng)瓶螺旋蓋不帶有濾膜，則應(yīng)將瓶蓋擰松，保持通氣狀態(tài)。4實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程。動(dòng)作要輕柔，安裝吸頭、打開(kāi)或封閉瓶口等操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過(guò)燒灼后進(jìn)行。操作時(shí)，避免講話、咳嗽，以防唾沫或呼出氣流造成污染。取用液體前不宜過(guò)早開(kāi)蓋，使用完畢應(yīng)立即封閉瓶口。吸取液體或細(xì)胞懸液時(shí)，應(yīng)專(zhuān)管專(zhuān)用，一旦吸管前端接觸了手或其他污染物時(shí)應(yīng)更換，吸出后殘留的液體不可重新加入原瓶，以防污染擴(kuò)大或造成培養(yǎng)物間的交叉污染。5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)將實(shí)驗(yàn)廢液或廢物及時(shí)移出無(wú)菌