水稻TOS17突變體庫的創(chuàng)建與應(yīng)用

1、 5/5水稻TOS17突變體庫的創(chuàng)建與應(yīng)用1文獻綜述 1.1 水稻基因組學研究現(xiàn)狀 1.1.2 水稻全基因組測序 水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的糧食作物之一，全世界有一半的人口食用它，水稻年總產(chǎn)量占世界糧食作物產(chǎn)量第三位，維持較多人口的生活。亞洲是世界水稻主產(chǎn)區(qū)，近年稻米產(chǎn)量占世界的90%以上，中國稻米年產(chǎn)量占亞洲的38%。大米作為我國主要糧食種類，在養(yǎng)活我國13億人口和改善我國居民營養(yǎng)結(jié)構(gòu)中具有舉足輕重的影響。同時，水稻又以其基因組相對較小(430Mbp)，高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，與玉米、大麥和小麥等其它禾本科作物在基因組上存在明顯的共線性，而成為研究單子葉植物的模式植物

2、。 國際水稻基因組計劃(IRGSP)啟動于1998年，以粳稻品種(japonica)日本晴(Nipponbare)為模式材料，由中國、日本、美國等是十個國家參與，所采用的方法為逐步克隆策略(clone by clone sequencing)，隨后在2002年由日本和中國科學家率先公布了第1、4染色體的精確序列(Feng et al., 2002; Sasaki et al., 2002; Consortium 2003)；2003年9月第10條染色體的全長序列由美國Clemson大學公布(Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium, 2003)。2005

3、年8月水稻全基因組精確序列在Nature發(fā)表(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。IRGSP公布的水稻“日本晴”精確序列經(jīng)過分析表明：(1) 水稻“日本晴”基因組大小為389Mb，IRGSP公布的序列能夠覆蓋其全基因組的95%，并包含了所有的常染色質(zhì)和兩個完整的著絲粒；(2) 整個基因組中包含大約37544個非轉(zhuǎn)座相關(guān)基因，其中71%的基因可能在擬南芥中有同源基因；(3) 通過與擬南芥基因組序列對比分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥90%的基因在水稻中可能存在同源物；(4) 水稻中預(yù)測的37544個基因中，29%是屬于成簇的基因家族；(5) 水

4、稻基因組中轉(zhuǎn)座元件的數(shù)目和種類與玉米和高粱基因組共線性區(qū)段的擴張是一致的；(6) 有證據(jù)證明基因能從細胞器中轉(zhuǎn)移到細胞核(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。 另外的一些科學研究部門和公司也分別啟動了各自的水稻測序計劃。如華大基因在2005年宣布完成秈稻品種“93-11”的全基因組序列測序，其所采用的方法為鳥槍法。Syngenta公司也于2002年宣布完成了粳稻品種“日本晴”的全基 因組序列測序。 隨著目前水稻基因組已測序完成，以及構(gòu)建了水稻高密度的遺傳圖譜和高質(zhì)量的物理圖譜(Chen et al., 2002)。同時獲得了超

5、過25萬條來源于水稻不同組織的ESTs及28000條全長cDNA序列(Kikuchi et al., 2003)。人們對有益基因的定位、克隆、轉(zhuǎn)移和聚合越來越關(guān)注。因此，可以說對水稻生命科學的研究步入到后基因組時代即對基因功能大規(guī)模研究的時代(Jeon et al., 2000)，其核心內(nèi)容是植物功能基因組學。因此，接下來的任務(wù)就是利用水稻功能基因組學，詮釋全基因組測序所獲得的遺傳信息，分析基因的功能。 1.1.3 基于突變體的水稻功能基因組研究 目前來講克隆分析基因最有效的方法，就是利用突變體來研究分析基因的功能。其基本原理是通過破壞植物基因內(nèi)部或鄰近位點，造成基因的突變。然后再利用各種方法

6、分離被破壞的基因。目前構(gòu)建飽和的基因突變?nèi)后w，通過突變體分析鑒定基因已經(jīng)成為最直接最有效的方法。在水稻測序完成之前，植物學家利用一些自然產(chǎn)生的突變體及利用物理和化學等方法產(chǎn)生的突變體，克隆了一些控制水稻重要農(nóng)藝性狀的基因(Yoshimura et al., 1996; Yoshimura et al., 1998; Yano et al., 2000)，但自然界自發(fā)產(chǎn)生的突變很少，頻率僅有10-5。所以目前有很多的方法通過人為的手段提高突變頻率，滿足與構(gòu)建大規(guī)模飽和突變題庫的需要。目前大規(guī)模構(gòu)建突變體庫的主要的方法有：物理和化學誘變法，T-DNA、轉(zhuǎn)座子及反轉(zhuǎn)綠轉(zhuǎn)座子插入突變等。 1.1.3.

7、1 物理和化學誘變 物理和化學誘變主要是利用一些物理和化學的手段如快中子(Fast neutron)、伽瑪射線(Gamma ray)、雙環(huán)氧丁二烯(Diepoxybutane, DEB)、甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS) 等方法處理種子，然后通過播種處理的種子來篩選突變表型?？熘凶愚Z擊法是物理方法中被認為是非常有效的一種方法，快中子轟擊往往導致基因組片段的缺失。而以EMS誘導為代表的化學誘變的方法，往往導致DNA中的堿基轉(zhuǎn)換，如G到A的轉(zhuǎn)換。物理和化學誘變的方法非常簡單，快速和經(jīng)濟且不存在組織培養(yǎng)或遺傳轉(zhuǎn)化匯總基因型的限制，被廣泛應(yīng)用于大型突變體庫的創(chuàng)建

8、，如Li等(2001)利用Deletegene系統(tǒng)，在水稻中構(gòu)建了含24,660個快中子轟擊群體，篩選到5個基因位點，得到一個位點發(fā)生缺失的突變體。而使用EMS作為化學誘變劑同樣也可以得到遺傳穩(wěn)定的點突變體，而且已經(jīng)被廣泛 用于水稻等植物誘變育種。但是物理和化學的方法處理得到突變體，只能通過圖位克隆的方法克隆基因，需要構(gòu)建龐大的克隆群體，精細的遺傳圖譜，費時費力，無法適應(yīng)大規(guī)模篩選鑒定突變體的要求。 1.1.3.2構(gòu)建插入突變體庫 利用T-DNA、轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子等插入元件，通過插入元件插入到植物基因組中，是植物基因不能正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯，達到破壞基因的效應(yīng)產(chǎn)生突變體，而且可以通過插入元件很

9、容易找到被插入元件的位點，目前構(gòu)建插入突變體是最有效的構(gòu)建大規(guī)模飽和突變體庫的方法。 元件的插入效應(yīng)是多樣的。Krysan等(1999)探討了元件插入到植物基因組中后引起的靶位點基因功能的變化的幾種情況：當插入元件插入到靶位點基因的編碼區(qū)或啟動子區(qū)就有可能使被插入的基因功能完全敲除，產(chǎn)生功能缺失性的突變體，即無義突變(null mutant)；當插入到啟動子或3端的非翻譯區(qū)就有可能使靶位點基因表達量下降；當元件接上一個35S的啟動子的時候，插入到基因的啟動子區(qū)域，就可以使基因表達量上升；當插入基因編碼區(qū)時，還有可能無法看到表型的缺失，因為高等植物中存在大量基因冗余的現(xiàn)象，突變基因的功能被其它同

10、家族的基因補償；在植物基因組內(nèi)部存在多個拷貝的元件插入是，有可能多個基因被同時敲除掉，使多個基因同時失活；元件的插入還有可能導致插入位點附近的染色體重排的現(xiàn)象，本實驗室張健同學的一個突變體就是由于插入位點附件的染色體重排，而引起植物出現(xiàn)一個不育的突變表型（私下交流）。 圖1.植物基因組中中由T-DNA插入引起靶基因表達的不同效應(yīng)（Kryson et al，1999） Fig1. The insertion of a T-DNA into a plant genome chromosome can lead to many different outcomes T-DNA(Transferred

11、 DNA)是農(nóng)桿菌(Agrobacterium)的Ti質(zhì)粒(Tumor-inducing Plasmid)上一段DNA序列，它可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定的整合到植物核基因組當中。農(nóng)桿菌介導的T-DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用于構(gòu)建擬南芥和水稻的插入失活突變體庫(Azpiroz-Leehan and Feldmann, 1997)。如在擬南芥中已經(jīng)建立飽和的插入突變體庫(Alonso et al., 2003)。隨著水稻粳稻的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立(Hiei Y et al., 1994)，水稻中的T-DNA插入突變體庫開始大量建立如本室已經(jīng)建立了超過120,000個含有T-DNA標簽的獨立的轉(zhuǎn)化子

12、，平均每個突變體含有約為2.0個T-DNA拷貝，并且能穩(wěn)定遺傳(Wu et al., 2003)，并且通過對突變體的篩選，克隆到了一系列的重要基因如RID1(Wu et al., 2008)。而其它的一些研究機構(gòu)也紛紛建立了大型的T-DNA插入突變體庫，如韓國的POSTECH研究所，法國的Genoplant研究所。T-DNA在擬南芥中的插入被認為是一個隨機的過程(Sallaud et al., 2004)，而在水稻中的插入則存在熱點，如比較傾向于插入水稻中較大的染色體，傾向于插入遠離著絲粒的區(qū)域，傾向于插入基因區(qū)，在基因的間隔區(qū)插入比較均一，傾向于插入基因編碼區(qū)(Zhang et al., 2

13、007)。而且T-DNA 插入也有一些缺點如：可能會引起插入位點的重排、插入過程中T-DNA的邊界序列容易缺失，并且組織培養(yǎng)容易激活其它元件如Tos17。 Tos17是水稻中的一個內(nèi)源性的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，全長4114bp，在栽培稻中含有1-5個拷貝(Cheng et al., 2006)，并且在日本晴中有兩個原始拷貝，一個位于第7染色體上，具有轉(zhuǎn)座子活性，另一個位于第10染色體上，沒有轉(zhuǎn)座子活性活性，而現(xiàn)在認為第10染色體上一段20bp的堿基缺失，造成其轉(zhuǎn)座活性的缺失。Hirochika等(1996)在1996年發(fā)現(xiàn)了15個水稻品種“日本晴” 中的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，其中Tos10，Tos17，Tos

14、19在組培的條件下被激活，經(jīng)過詳細研究后發(fā)現(xiàn)Tos17具有以下特點：1.Tos17在組培的條件下激活，分化成植株后失活，因此Tos17插入引起的突變可以穩(wěn)定遺傳；2.Tos17的拷貝數(shù)隨著組培的時間而增多，經(jīng)5個月的組培后，可平均產(chǎn)生10個拷貝，可以通過組培時間的長短來控制轉(zhuǎn)座的拷貝數(shù)；3.突變體產(chǎn)生過程不涉及轉(zhuǎn)基因。4.Tos17是水稻內(nèi)源性的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，因此在插入植物基因組內(nèi)部時，一般不會產(chǎn)生片段的缺失和改變，而且相對于T-DNA，Tos17突變體的側(cè)翼序列的分離相對容易。因此Hirochika認為Tos17很適合用來構(gòu)建插入突變體庫。并構(gòu)建了超過50,000個獨立的再生植株，大約含有5

15、00,000個插入位點，并對M2代突變產(chǎn)生的表型進行了詳細的分類(Miyao et al., 2003; 2007)，發(fā)現(xiàn)后代中大約50%的家系出現(xiàn)至少一個突變表型，在田間出現(xiàn)最多的表型是不育和矮化。但是Tos17突變體庫也有一些缺點如其插入的拷貝數(shù)多，對以后的遺傳分析不利；其產(chǎn)生的突變體只有10%是真正由Tos17的插入引起的，其余的突變體是在組培的情況下或是由其它的未知的轉(zhuǎn)座子專座產(chǎn)生的。 Miyao等(2003)通過大量的Tos17的插入位點的分析發(fā)現(xiàn)，Tos17在水稻中的插入事件并不是一個隨機的過程，存在熱點，Tos17偏向于插入水稻中的較大的染色體，且插入密度和染色體大小高度相關(guān)。在染色體兩端分布較多，在著絲粒附近和染色體中部分部較少。偏向于插入基因區(qū)，而極度不偏向插入轉(zhuǎn)座子相關(guān)基因和基因間隔區(qū)以及基因調(diào)控區(qū)。偏愛于插