酵母雙雜交(自激活)

1、酵母雙雜交(自激活)第1頁，共15頁，2022年，5月20日，20點56分，星期三真核生物的轉錄因子是由兩個可以分開的、功能上相互獨立的結構域(domain)組成的。一、原理酵母的轉錄激活因子GAL4，在N端有一個由147個氨基酸組成的DNA結合域(DNA binding domain,BD)，C端有一個由113個氨基酸組成的轉錄激活域(transcription activation domain,AD)。第2頁，共15頁，2022年，5月20日，20點56分，星期三 GAL4分子的BD可以同上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)結合。 AD則能激活

2、UAS下游的基因進行轉錄。單獨的BD和AD都不能激活UAS的下游基因，它們之間只有通過某種方式結合在一起才具有完整的轉錄激活功能。第3頁，共15頁，2022年，5月20日，20點56分，星期三第4頁，共15頁，2022年，5月20日，20點56分，星期三第5頁，共15頁，2022年，5月20日，20點56分，星期三His, -gal第6頁，共15頁，2022年，5月20日，20點56分，星期三 一般情況下，單獨的 BD 可以與 GAL4 上游活化序列（GAL UAS）結合，但不能引起轉錄。然而，將一段具有轉錄激活活性的轉錄因子基因構建到BD載體上，若其表達產(chǎn)生的 BD 單獨與 UAS 結合也可

3、以引起下游報告基因的轉錄，那么就稱之為酵母雙雜中的自激活現(xiàn)象。反過來，可以利用這種自激活現(xiàn)象來驗證某個轉錄因子是否具有轉錄激活活性。第7頁，共15頁，2022年，5月20日，20點56分，星期三His, -gal自激活原理Transcription factorsGAL4BD第8頁，共15頁，2022年，5月20日，20點56分，星期三YPDA液體 500ml固體 100ml蛋白胨10g2g酵母提取物5g1g瓊脂2g0.2%ade10ml2ml葡萄糖10g2gYPDA培養(yǎng)基0.2g ade定容至 100ml 0.2%的ade母液pH 6.5 滅菌 121 15min第9頁，共15頁，2022年

4、，5月20日，20點56分，星期三正對照：pGAL4負對照： pBD-GAL4第10頁，共15頁，2022年，5月20日，20點56分，星期三將-70下凍存的酵母菌在YPAD平板上劃線，倒置于30培養(yǎng)2-3天。挑取2-4個大菌落（直徑2-3mm）于1.5ml YPAD液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩5min，打散菌落，接種于50ml YPAD液體培養(yǎng)基中（250ml三角瓶），230-250轉/min，30培養(yǎng)18-24hr。取菌液測定其OD600值，需達到1.5。若不到，再培養(yǎng)12hr，若還不到，換單克隆重搖。取50ml菌液于300mlYPAD培養(yǎng)基中（1-2L大三角瓶），30，230rpm，搖培3hr

5、，至 OD600值為0.40.6。4000rpm 5min 于常溫收集菌體，重復一次。室溫下1000g離心5min，去上清，加入50ml 超純水清洗懸浮3次。1000g離心5min，棄上清，用新配的1.5ml 1TE/LiAc重懸細胞，置冰上，即成為酵母感受態(tài)細胞。（只能現(xiàn)做現(xiàn)用，不能貯存，室溫只能放置1-2hr）。酵母菌株感受態(tài)細胞制備：第11頁，共15頁，2022年，5月20日，20點56分，星期三 酵母轉化鮭魚精 DNA（20g/l）沸水中煮20min，冰上冷卻10min。加入100l酵母感受態(tài)細胞、12l構建質粒（約200ng）、100g鮭魚精、600l TE-LiAc-PEG，變速渦

6、旋10s1min至混勻。30，200rpm/min，恒溫搖床振蕩30min。加入70l DMSO，溫和顛倒混勻。42水浴熱休克15min，后冰浴10min。常溫下，3000rpm離心10s；棄上清（去干凈），用0.5ml 1TE重懸細胞。（ 1TE室溫只能放置12hr）將轉化后的酵母培養(yǎng)于SD/-Trp培養(yǎng)基上，30倒置培養(yǎng)約3-5天，直至出現(xiàn)菌落。第12頁，共15頁，2022年，5月20日，20點56分，星期三陽性克隆的篩選： 將在SD/-Trp培養(yǎng)基上長出的酵母菌落轉移到SD/-His培養(yǎng)基上進行篩選。30培養(yǎng)2天，檢查生長情況。 對生長狀態(tài)較好的單克隆進行-半乳糖苷酶活性分析。第13頁，共15頁，2022年，5月20日，20點56分，星期三-半乳糖苷酶活性分析（酵母克隆濾紙顯色分析）取2ml的Z緩沖液/X- gal溶液潤透2張濾紙；小心取一張濾紙覆蓋于生長有轉化子的平皿上，用涂布棒小心趕出氣泡，使濾紙盡可能與酵母菌接觸（1min）；用一根針在濾紙上刺個小孔以標記菌落位置，用鑷子輕輕取出濾紙，沾有菌的面朝上置液氮中10s，夾出濾紙，室溫解凍；重復3次；沾有菌的面朝上，緊貼于預先用Z緩沖液/X-gal溶液潤透過的那張濾紙上，同時吸掉多余的Z緩沖液/X-g