《RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)》01 mRNA的分離純化

1、8/8mRNA的分離純化【實(shí)驗(yàn)原理】真核生物的mRNA分子是單順?lè)醋?，是編碼蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。真核生物的所有蛋白質(zhì)歸根到底都是mRNA的翻譯產(chǎn)物，因此，高質(zhì)量mRNA的分離純化是克隆基因、提高cDNA文庫(kù)構(gòu)建效率的決定性因素。哺乳動(dòng)物平均每個(gè)細(xì)胞含有約1x10-5g RNA，理論上認(rèn)為每克細(xì)胞可分離出510mg RNA。其中rRNA為75 85，tRNA占1016，而mRNA僅占1%5，并且mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一，表達(dá)豐度也不一樣。 真核生物mRNA有特征性的結(jié)構(gòu)，即具有5端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3端的poly(A)尾巴絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的3端存在20300個(gè)腺苷酸組成的p

2、oly（A）尾，通常用poly（A+）表示，這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA分子的提取、純化，提供了極為方便的選擇性標(biāo)志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。 一般mRNA分離純化的原理就是根據(jù)mRNA 3 末端含有多poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)特性設(shè)計(jì)的。當(dāng)總RNA流經(jīng)寡聚（dT）（即oligo(dT)）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過(guò)兩次oligo(dT)纖維素柱，即可得到較純的mRNA。 目前常用的mRNA的純化方法有： （1）寡聚（dT）纖維素柱層析法，即分離mR

3、NA的標(biāo)準(zhǔn)方法； （2）寡聚（dT）纖維素液相離心法，即用寡聚（dT）纖維素直接加入到總的 RNA溶液中并使mRNA與寡聚（dT）纖維素結(jié)合，離心收集寡聚（dT）纖維素mRNA復(fù)合物，再用洗脫液分離mRNA，然后離心除去寡聚（dT）纖維素； （3）其它一些方法：如寡聚（dT）磁性球珠法等。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用方法（1）進(jìn)行mRNA的分離純化。【試劑與器材】（一）試劑1 0.1mol/L NaOH ，每組200mL 2 寡聚Oligo（dT）-纖維素3 加樣/洗滌緩沖液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL或0.5mol/L NaCl,

4、 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。4 洗滌緩沖液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。 配制時(shí)可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65時(shí)，加入經(jīng)65溫育（30min）的10%SDS至終濃度。5 5 mol/L NaCl，每組10

5、mL6 3 mol/L NaAc pH5.2，每組10mL7 無(wú)RNase雙蒸水(DEPC水)，每組100mL8 70%乙醇，每組10mL注意：溶液5，6的配制都應(yīng)該加0.1% DEPC處理過(guò)夜，溶液1，3，4，8則用經(jīng)0.1% DEPC處理過(guò)的無(wú)RNase雙蒸水配制，Tris應(yīng)選用無(wú)RNase的級(jí)別。溶液配制后，最好能夠按一次實(shí)驗(yàn)所需的分量分裝成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存，每次實(shí)驗(yàn)只用一份，避免多次操作造成對(duì)溶液的污染。（二）器材1 恒溫水浴箱2 冷凍高速離心機(jī)3 紫外分光光度計(jì)4 巴斯德吸管5 玻璃棉6 5ml一次性注射器【操作方法】（一） oligo(dT)纖維素的預(yù)處理1 用

6、0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。 2 將懸浮液裝入填有經(jīng)DEPC水處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0mL，用3倍柱床體積的無(wú)RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo(dT)纖維素。 3 用3-5倍柱床洗滌緩沖液I沖洗oligo(dT)纖維素，直到流出液的pH值小于8.0。4 將處理好的oligo(dT)纖維素從巴斯德吸管倒出，用適當(dāng)?shù)闹蚕礈炀彌_液I懸浮，濃度約為0.1g/mL，保存在4待用。（二） 總RNA濃度的調(diào)整1 把實(shí)驗(yàn)一所提的總RNA轉(zhuǎn)到適合的離心管中，如果總RNA的濃度大于0.55mg/mL，則用無(wú)RNase的雙蒸

7、水稀釋至0.55mg/mL，總RNA的濃度對(duì)除去rRNA是很重要的。把RNA溶液置于65水浴加熱5 分鐘，然后迅速插在冰上冷卻。2 加入1/10體積5 mol/L NaCl使RNA溶液中鹽的濃度調(diào)至0.5 mol/L。（三） mRNA的分離1 mRNA與Oligo(dT)-纖維素結(jié)合：用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素，按下表取適量的oligo(dT)-纖維素到RNA樣品中，蓋上蓋子，顛倒數(shù)次將oligo(dT)-纖維素與RNA混勻。于37水浴保溫并溫和搖蕩15分鐘?？俁NA (mg)寡聚Oligo(dT)-纖維素(mL)洗滌緩沖液1，2 (mL)洗脫體積(mL)0.20.21.01.

8、00.2-0.50.51.51.50.5-1.01.03.03.01.0-2.02.05.05.02 轉(zhuǎn)移：取1個(gè)5ml的一次性注射器，取適量經(jīng)過(guò)高溫滅菌的玻璃棉塞緊前端，并把它固定在無(wú)RNase的支架上，再把oligo(dT)-纖維素/RNA懸浮液轉(zhuǎn)移到注射器，推進(jìn)塞子直至底部，把含有未結(jié)合上的RNA液體排到無(wú)RNase的離心管中（保留至確定獲得足夠的mRNA）。3 洗滌：根據(jù)上表直接用注射器慢慢吸取適量的洗滌緩沖液1，溫和振蕩，充分重新懸浮mRNA-oligo(dT)-纖維素，推進(jìn)塞子，用無(wú)RNase的離心管收集洗出液。測(cè)定每一管的OD260，當(dāng)洗出液中OD為0時(shí)準(zhǔn)備洗脫。4 洗脫：根據(jù)上

9、表直接用注射器慢慢吸取適量（2-3倍柱床體積）的洗脫緩沖液2或無(wú)RNase雙蒸水到注射器內(nèi)充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素，推進(jìn)塞子以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。5 測(cè)定每一管的OD260，合并含有RNA的洗脫液組分于4，2500g，離心2-3分鐘，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，去掉殘余的oligo(dT)-纖維素。6 沉淀：洗脫液中加入1/10體積的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻后，-2030分鐘或放置過(guò)夜。7 離心收集：12000g, 4離心15分鐘，小心棄去上清，mRNA沉淀此時(shí)往往看不見(jiàn)，用70%乙醇漂洗沉淀，12000g,

10、 4離心5 分鐘，小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。將mRNA沉淀溶于適當(dāng)體積的無(wú)RNase的雙蒸水，立即用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70）。8 定量：測(cè)定OD260和OD280，計(jì)算產(chǎn)率以及OD260/OD280的比率（同上一實(shí)驗(yàn)）。【注意事項(xiàng)與提示】1 整個(gè)操作過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)oRNase操作環(huán)境規(guī)則。2 提取的總RNA必須完整，不能被降解，這是mRNA質(zhì)量的先決條件。3 總RNA與Oligo(dT)-纖維素的比例要適當(dāng)，過(guò)量的總RNA，容易造成mRNA不純。4 RNA溶液與Oligo(dT)-纖維素結(jié)合前必須置于65加熱5 分鐘，這一步很重要，

11、其作用（1）破壞mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，特別是poly(A+)尾處的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解離mRNA與rRNA的結(jié)合。加熱后應(yīng)立即插入冰上，以免由于溫度的緩慢下降使mRNA又恢復(fù)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。5 應(yīng)注意mRNA不能被DNA污染，即使是1 ppm DNA污染，也可嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。6 mRNA制備后，可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測(cè)其完整性和有無(wú)DNA污染。提取的mRNA應(yīng)該在0.58.0kb之間呈現(xiàn)彌散狀，無(wú)明顯區(qū)帶，但大部分的mRNA應(yīng)在1-2.0kb范圍內(nèi)（如下圖）。一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)一次純化分離的mRNA還會(huì)有微量的rRNA殘留，但一般來(lái)說(shuō)不會(huì)

12、對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成很大的影響，如果樣品充足，可將經(jīng)過(guò)一次純化分離的mRNA再純化一次，進(jìn)一步提高其純度。圖3.1 mRNA變性瓊脂糖凝膠電泳示意圖Lane 1, 0.247.5kb RNA分子量Maker;Lane 2, 老鼠肝臟總 RNA;Lane 3, 老鼠肝臟mRNA7 為防止mRNA降解，應(yīng)避免多次凍融，可將mRNA少量分裝后保存。另外，如果有低溫冰箱,最好在 -70 -80保存。 也可將mRNA在70%乙醇中-70保存一年以上。8 寡聚(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復(fù)使用。每次用前需用Na

13、OH、滅菌 ddH2O、層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。9 一般而言，107哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞能提取1-5g Poly(A+)RNA，約相當(dāng)于上柱總RNA量的1%-2%?！緦?shí)驗(yàn)安排】1 第一天：試劑的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase處理（0.1%DEPC浸泡或高溫干烤）。2 第二天：進(jìn)行（一）、（二）和（三）1-6。3 第三天：進(jìn)行（三）7和變性瓊脂糖凝膠電泳撿測(cè)mRNA。4 為了避免由于保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成的RNA降解，最好能將總RNA提取、mRNA的分離純化、RT-PCR和cDNA文庫(kù)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)安排在連續(xù)的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。其他：引物的設(shè)計(jì)一般遵循的原則：1）典型的引物20-24個(gè)核苷長(zhǎng)。

14、引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是太長(zhǎng)的引物可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交降低了特異性，同時(shí)因?yàn)?比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。2）設(shè)計(jì)5端和中間區(qū)為G或C，且GC含量為5060的引物，以增加引物的穩(wěn)定性及其與目的序列雜交的穩(wěn)定性。3）3末端盡量不要富含GC。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。但因?yàn)?端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸，為了避免3末端的錯(cuò)誤配對(duì)，所以末端盡量避免為核苷A。4）在引物對(duì)3末端盡量避免互補(bǔ)序列以免形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。如果引物序列可能產(chǎn)生內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)破壞引物退火穩(wěn)定性，也要盡量避免。此外，目的序列上并不存在的附加序列，如限制位