DNA測(cè)序技術(shù)的原理、發(fā)展及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1、DNA測(cè)序技術(shù)的原理、發(fā)展及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用DNA測(cè)序技術(shù)DNA是一種長(zhǎng)鏈聚合物，組成單位為四種脫氧核苷酸(dATP dTTP dCTP dGTP)。這些堿基沿著DNA長(zhǎng)鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。測(cè)序分析能夠?yàn)榛駾NA序列提供最真實(shí)可靠的信息，它可以比較全面地描述基因的復(fù)雜性和多樣性。DNA測(cè)序技術(shù)測(cè)定未知序列 研究基因組多樣性 確定重組DNA的方向與結(jié)構(gòu) 對(duì)突變進(jìn)行定位和鑒定DNA測(cè)序的發(fā)展歷程經(jīng)典DNA測(cè)序技術(shù) 70年代末，Maxam和Gilbert發(fā)明化學(xué)法、Sanger發(fā)明雙脫氧終止法手動(dòng)測(cè)序（同位素標(biāo)記） 80年代中期，出現(xiàn)自動(dòng)測(cè)序儀（應(yīng)用Sanger雙脫

2、氧終止法原理）、熒光代替同位素，采用計(jì)算機(jī)圖象識(shí)別 90年代中期，測(cè)序儀重大改進(jìn)、集束化的毛細(xì)管電泳代替凝膠電泳 2001年完成人類基因組框架圖，全部采用基于Sanger雙脫氧原理的自動(dòng)化毛細(xì)管測(cè)序。 DNA測(cè)序的發(fā)展歷程DNA測(cè)序的發(fā)展歷程第二代測(cè)序技術(shù)DNA測(cè)序的發(fā)展歷程454 的特點(diǎn)與主要應(yīng)用讀長(zhǎng)較長(zhǎng)，400600bp通量較低，400600Mb相對(duì)成本較高主要應(yīng)用：de novo測(cè)序DNA測(cè)序的發(fā)展歷程Solexa 的特點(diǎn)與主要應(yīng)用讀長(zhǎng)較短，100150bp通量高主要應(yīng)用：RNA測(cè)序、表觀遺傳學(xué)研究DNA測(cè)序的發(fā)展歷程SOLiD 的特點(diǎn)與主要應(yīng)用讀長(zhǎng)較短，50-75bp精度高，通量高，

3、主要應(yīng)用：基因組重測(cè)序、SNP檢測(cè)等DNA測(cè)序的發(fā)展歷程三種第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)比DNA測(cè)序的發(fā)展歷程第三代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)在制備測(cè)序文庫(kù)的時(shí)候都需要經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，而這一PCR過(guò)程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子的比例關(guān)系。另外，第二代測(cè)序的讀長(zhǎng)普遍偏短，在進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接時(shí)會(huì)遇到麻煩。為了克服這樣的缺點(diǎn)，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實(shí)時(shí)測(cè)序和納米孔為標(biāo)志的第三代測(cè)序技術(shù)。 DNA測(cè)序的發(fā)展歷程第三代測(cè)序技術(shù) 雙脫氧鏈末端合成終止法1977年，英國(guó)人Frederick Sanger 創(chuàng)建了雙脫氧鏈末端合成終止法（chain termination method），簡(jiǎn)稱Sanger法、雙脫氧法或酶法。

4、他發(fā)現(xiàn)如果在DNA復(fù)制過(guò)程中摻入ddNTP，就會(huì)產(chǎn)生一系列末端終止的DNA鏈，并能通過(guò)電泳按長(zhǎng)度分辨。不同末端終止DNA鏈的長(zhǎng)度是由摻入到新合成鏈上隨機(jī)位置的ddNTP決定的。 雙脫氧鏈末端合成終止法雙脫氧鏈末端合成終止法雙脫氧鏈末端合成終止法雙脫氧鏈末端合成終止法基本原理是利用DNA聚合酶，以待測(cè)單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加入不同的雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測(cè)序引物引導(dǎo)下，按照堿基配對(duì)原則，每個(gè)反應(yīng)體系中合成一系列長(zhǎng)短不一的引物延伸鏈，通過(guò)高

5、分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后，從凝膠底部到頂部按53方向讀出新合成鏈序列，由此推知待測(cè)模板鏈的序列 。雙脫氧鏈末端合成終止法測(cè)序時(shí)分成四個(gè)反應(yīng), 每個(gè)反應(yīng)除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A, C, G, T核苷三磷酸（稱為ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后進(jìn)行聚合反應(yīng)。在第一個(gè)反應(yīng)中, ddATP會(huì)隨機(jī)地代替dATP參加反應(yīng)，一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈，由于其第3位的-OH變成了-H, 所以不能繼續(xù)延伸,于是第一個(gè)反應(yīng)中所產(chǎn)生的DNA鏈都是到A就終止了。具體操作雙脫氧鏈末端合成終止法雙脫氧鏈末端合成終止法引物在DNA聚合酶催化的測(cè)

6、序反應(yīng)中需要測(cè)序引物。不論是單鏈DNA模板，還是雙鏈DNA模板，都可通過(guò)使用克隆位點(diǎn)兩側(cè)的載體序列互補(bǔ)的“通用”引物。通用引物的長(zhǎng)度一般為1530個(gè)核苷酸。如果是PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，也可以用一端的PCR引物雙脫氧鏈末端合成終止法測(cè)序酶（sequenase）測(cè)序酶是一種經(jīng)過(guò)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶，消除了35外切酶活性。該酶活性非常穩(wěn)定，具有很高的鏈延伸能力和極快的聚合反應(yīng)速度，是測(cè)定較長(zhǎng)DNA的首選酶。雙脫氧鏈末端合成終止法測(cè)序產(chǎn)物的凝膠電泳及識(shí)讀能否將測(cè)序反應(yīng)中產(chǎn)生的各種不同長(zhǎng)度的DNA片段進(jìn)行有效分離是序列分析成敗的關(guān)鍵。最早采用放射性標(biāo)記引物，后來(lái)采用熒光劑標(biāo)記。DNA序列分析的自動(dòng)

7、化激光測(cè)序法終止標(biāo)記系統(tǒng)是用4種不同的熒光染料標(biāo)記不同的ddNTP。測(cè)序反應(yīng)可以在同一反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，不必分成4管，反應(yīng)產(chǎn)物按終止位置的堿基不同其3末端帶有不同的熒光基團(tuán)，被激發(fā)后產(chǎn)生不同的熒光，將反應(yīng)產(chǎn)物加樣于凝膠的同一加樣孔，電泳分離后，經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序儀分析系統(tǒng)識(shí)別，將檢測(cè)將信號(hào)不斷傳送到計(jì)算機(jī)，通過(guò)軟件分析，自動(dòng)讀出待測(cè)DNA的全部核苷酸序列 。DNA序列分析的自動(dòng)化DNA序列分析的自動(dòng)化毛細(xì)管電泳 毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis, CE）是以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，在毛細(xì)管內(nèi)使荷電粒子按淌度或分配系數(shù)進(jìn)行分離的一種電泳技術(shù)。具有分辨率高、重現(xiàn)性好、靈敏度高、

8、快速和易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法基本原理：直接或間接特異性識(shí)別4 種堿基特定化學(xué)試劑可對(duì)堿基進(jìn)行特異性修飾在修飾堿基處(5或3)打斷磷酸二酯鍵將一個(gè) DNA 片段的 5 端磷酸基作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué)方法修飾和裂解特定堿基，從而產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度不一而 5 端被標(biāo)記的 DNA 片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過(guò)凝膠電泳分離，再經(jīng)放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的 DNA 的堿基序列。Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法操作步驟 先用限制性內(nèi)切酶把DNA切成10200bp 的測(cè)序材料； 用堿性磷酸化酶處理該片段，消除5末端上

9、的磷酸； 在5OH端標(biāo)記 32P，用多核苷酸磷酸激酶催化； 標(biāo)記片段變性為單鏈； 用特異的化學(xué)試劑作用于不同的堿基進(jìn)行修飾，然后用哌啶甲酸切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸鏈，緊接著用四組不同的特異反應(yīng)可以使末端標(biāo)記的DNA分子切成不同長(zhǎng)度的片段， 產(chǎn)生一組其末端都是該特異堿基的長(zhǎng)度不等的DNA片段； 經(jīng)電泳和放射性自顯影后，從4個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)統(tǒng)一閱讀，待測(cè)DNA的全部核苷酸序列就可直接讀出Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法該反應(yīng)的關(guān)鍵在于使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發(fā)生特異性的化學(xué)切割反應(yīng)：堿基的特異性修飾；修飾的堿基從核糖環(huán)上轉(zhuǎn)移；失去堿基

10、的糖環(huán)部位發(fā)生DNA鏈斷裂。專門用來(lái)對(duì)核苷酸作化學(xué)修飾，并打斷磷酸二酯鍵的化學(xué)試劑有硫酸二甲酯（dimethylsulphate)和肼(hydrazine)、哌啶甲酸等。 Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法 肼，又稱聯(lián)氨 NH2.NH2 在堿性環(huán)境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置導(dǎo)致糖苷鍵斷裂。 如果加入高濃度的鹽（1.5M NaCl），肼則主要作用于胞嘧啶C使之?dāng)嗔选?在高溫強(qiáng)堿作用(90,1.2M NaOH)下可使腺嘌呤A位點(diǎn)發(fā)生劇烈的斷裂反應(yīng),但對(duì)胞嘧啶C的反應(yīng)較弱胸腺嘧啶胞嘧啶Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法硫酸二甲酯dimethyl sulpha

11、te ，DMS ，（CH3O）2SO2： 一種堿性化學(xué)試劑，可以使DNA鏈上的腺嘌呤A的N2和鳥嘌呤G的N甲基化，但是鳥嘌呤G的N甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度要快4-10倍，并且在中性pH環(huán)境中，DMS主要作用于鳥嘌呤G，使之甲基化，導(dǎo)致糖苷鍵斷裂。哌啶甲酸(90,1mol/L)在修飾位點(diǎn)兩端使DNA的糖-磷酸鏈斷裂 在4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地?cái)嗔袲NA的機(jī)制是： G+A反應(yīng)-（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。 G反應(yīng)-硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后斷開了C8-C9間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾

12、鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。 T+C反應(yīng)-肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。 C反應(yīng)-在NaCl存在時(shí)，只有C才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法5 GATCACTACTG 3 標(biāo)記5 *GATCACTACTG 3 G：DMSC：肼（加鹽）G+A：甲酸C+T：肼5-*GATCACTACTG 5-*G 5-*GATCACTACTG 5-*GATCACTA 5-*GATCA5-*GA 5-*G 5-*GATCACTAC 5-*GATCACT 5-*GATCAC5-*GATC 5-*GAT 5-*

13、GATCACTACT 5-*GATCACTACTG- 5-*GATCACTAC 5-*GATCAC5-*GATC -*GATCACTACTG- Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法在化學(xué)修飾反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，只有一小部分堿基被修飾(而不是全部被修飾)，隨后進(jìn)行的斷裂反應(yīng)也是定量反應(yīng)。因此，DNA鏈并不是在所有可被修飾的堿基位點(diǎn)斷裂，而是隨機(jī)斷裂。在4個(gè)反應(yīng)中，產(chǎn)生4套帶相同標(biāo)記末端、長(zhǎng)短不一的寡聚核苷酸片段。只有帶標(biāo)記末端的片段可被識(shí)別，沒有標(biāo)記末端的片段可以忽略不計(jì)。Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法M

14、axam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法如果G+A中出現(xiàn)1條帶就看G列中是否有同樣大小的帶，若有即為G堿基，無(wú)則為A堿基；同理，C+T中則檢查C列中有無(wú)同樣大小條帶，有即為C，無(wú)則為T。Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法 化學(xué)法測(cè)序采用32P標(biāo)記DNA進(jìn)行，條帶會(huì)較末端法更模糊，更寬，由于分辨率不足，從單塊凝膠上能得到可靠序列數(shù)量約為200-300bp以內(nèi)。Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法優(yōu)點(diǎn)：不需要進(jìn)行酶催化反應(yīng)，因此不會(huì)產(chǎn)生由于酶催化反應(yīng)而帶來(lái)的誤差；對(duì)未經(jīng)克隆的 DNA 片段可以直接測(cè)序；化學(xué)降解測(cè)序法特別適用于測(cè)定含有如 5-甲基腺嘌呤 A 或者 G ，

15、C 含量較高的 DNA 片段，以及短鏈的寡核苷酸片段的序列。 化學(xué)降解測(cè)序法既可以標(biāo)記 5-末端，也可以標(biāo)記 3-末端。如果從兩端分別測(cè)定同一條 DNA 鏈的核苷酸序列，相互參照測(cè)定結(jié)果，可以得到準(zhǔn)確的 DNA 鏈序列。Maxam-Gilbert DNA 化學(xué)降解法缺點(diǎn)： 沒有改進(jìn),操作繁瑣, 化學(xué)試劑的毒性大,放射性同位素標(biāo)記效率偏低以致需要較長(zhǎng)的放射自顯影曝光時(shí)間,人工讀取數(shù)據(jù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力. 目前,僅在分析特殊DNA鏈的核苷酸序列和分析DNA和蛋白質(zhì)相互作用中的DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)才使用DNA測(cè)序在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用在人類疾病基因研究的應(yīng)用對(duì)遺傳病的預(yù)防和治療基因診斷基因治療DNA測(cè)序在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用19

16、86年由美國(guó)學(xué)者提出的，目前正在實(shí)施的人類基因組計(jì)劃(human genome project)，則是要通過(guò)對(duì)人類基因組全序列的序列分析和人類基因的染色體圖譜制定達(dá)到了解其結(jié)構(gòu)，認(rèn)識(shí)其功能，即從分子遺傳學(xué)水平來(lái)認(rèn)識(shí)人類自身的結(jié)構(gòu)和功能特征的目的。人類疾病相關(guān)的基因是人類基因組中結(jié)構(gòu)和功能完整性至關(guān)重要的信息。DNA測(cè)序在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用HGP對(duì)人類疾病基因研究的貢獻(xiàn)對(duì)于單基因病，采用“定位克隆”和“定位候選克隆”的全新思路，利用DNA序列分析技術(shù)，導(dǎo)致了亨廷頓舞蹈病、遺傳性結(jié)腸癌和乳腺癌等一大批單基因遺傳病致病基因的發(fā)現(xiàn)。對(duì)于心血管疾病、腫瘤、糖尿病、神經(jīng)精神類疾?。ɡ夏晷园V呆、精神分裂癥）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重點(diǎn)。 DNA測(cè)序在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用基因診斷治療基因診斷是直接從DNA水平檢測(cè)人類疾病中的缺陷基因或相關(guān)基因。基因診斷可用于對(duì)遺傳性疾病的診斷、傳染性病原體的檢測(cè)、產(chǎn)前檢測(cè)以及確定親緣關(guān)系等，如對(duì)地中海貧血癥、先天愚型、血友病的診斷等。 基因治療是以基因轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)，將某種遺傳物質(zhì)導(dǎo)入患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)并發(fā)揮作用，從而達(dá)到治療疾病目的的一種方法。D