海洋來源的口蛄蝦生物堿的分離純化和抗鼻咽癌作用研究

1、海洋泉源的口蛄蝦生物堿的分散純化和抗鼻咽癌作用研究葉才果，潘海燕，黃培春，何志巍【摘要】目的從海洋泉源的口蛄蝦中提取并純化該生物堿，研究其抗鼻咽癌作用。要領(lǐng)體系溶劑法開端分散口蛄蝦乙醇粗提物，大孔樹脂HP20層析分散正丁醇洗脫的組分；對富含生物堿的組分歸并后萃取總生物堿；主動層析儀純化總生物堿，254n波長檢測，手動網(wǎng)絡(luò)洗脫液；質(zhì)譜儀闡發(fā)生物堿分子量；TT要領(lǐng)檢測藥物對細(xì)胞的生長按捺率，繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果大孔樹脂HP20能非常有用地富集分散的生物堿，質(zhì)譜闡發(fā)純化的生物堿D3分子量為234.33。分散純化的生物堿對鼻咽癌細(xì)胞增殖具有顯著的按捺作用。結(jié)論口蛄蝦泉源的生物堿分子量為234.33，

2、對鼻咽癌細(xì)胞的增殖具有顯著的按捺作用，并呈時(shí)間-劑量干系。【關(guān)鍵詞】口蛄蝦；生物堿；鼻咽癌；純化Keyrds：ratsquilla；Alkalid；Naspharyngealarina；Purifiatin本研究所使用鼻咽癌細(xì)胞株對一批海洋生物舉行藥物活性挑選，創(chuàng)造了一些具有按捺鼻咽癌細(xì)胞系增殖，同時(shí)也可以抗EB病毒(Epstein-BarrVirus)增殖的海洋生物1，2，此中口蛄蝦乙醇粗提物按捺結(jié)果最顯著，并申請了中國創(chuàng)造專利(專利號：ZL99102633.0)。我們以往的實(shí)行證明口蛄蝦單次乙醇提取物能明顯按捺人鼻咽癌細(xì)胞系NE1、NE-2Z的DNA合成，低落細(xì)胞活性和細(xì)胞集落形本錢領(lǐng)周鴻

3、科.?海洋生物1號對人鼻咽癌細(xì)胞系NE-2Z生長的影響及其機(jī)制的研究?.2022,廣東醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文。動物實(shí)行證明乙醇粗提物能按捺人低分化鼻咽癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移顧帝水.?海洋生物1號對人鼻咽癌細(xì)胞系NE-2Z轉(zhuǎn)移特性及其裸鼠轉(zhuǎn)移瘤的影響?.2022,廣東醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文。本實(shí)行在進(jìn)一步對活性組分分散純化的底子上，結(jié)合前期的實(shí)行底子，確定活性物質(zhì)的種類和分子信息正是本研究要辦理的題目，以期為進(jìn)一步將其開拓成為有用治療鼻咽癌的新藥創(chuàng)立可靠的實(shí)行底子和根據(jù)。1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1細(xì)胞造就和藥物挑選NE1和NE-2Z鼻咽癌細(xì)胞系用含10%小牛血清的細(xì)胞造就液RPI-1640通例造就(37，

4、52)。取對數(shù)生恒久，生長狀態(tài)好的細(xì)胞用于實(shí)行。細(xì)胞接種于96孔造就板，每孔200l，1104個(gè)細(xì)胞。設(shè)置4個(gè)藥物濃度，別離為50，100，200，400g/l，含DS(0.1)的生長液為陰性比較，40g/l5-Fu作陽性比較。詳細(xì)操縱和檢測參考文獻(xiàn)3要領(lǐng)。1.2生物堿分散純化接納95食用乙醇冷浸漬法從口蛄蝦中得到乙醇粗提物4。顛末體系溶劑法開端分散，大孔樹脂HP20層析進(jìn)一步分散、歸并得到總生物堿，稱為D，顯色要領(lǐng)見文獻(xiàn)5。主動層析儀SHQT-6A純化總生物堿，得組份D1D4，純化后得生物堿D3。1.3生物堿質(zhì)譜闡發(fā)用闡發(fā)純的甲醇溶解配制成1g/l的液體，混懸振蕩器振蕩10in，然后1200

5、0r/in高速離心。上清液用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀島津DP8080闡發(fā)。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)闡發(fā)實(shí)行數(shù)據(jù)資料均用s表現(xiàn)，接納統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SAS8.0舉行統(tǒng)計(jì)學(xué)闡發(fā)。別離選用直線回歸法、重復(fù)丈量資料的方差闡發(fā)和單因素方差闡發(fā)要領(lǐng)。2結(jié)果2.1純化的生物堿對NE1和NE-2Z的按捺作用生物堿對NE1、NE-2Z細(xì)胞均有顯著的按捺作用，并呈時(shí)間劑量依靠干系。見圖1。結(jié)果表現(xiàn)各組間差異具有明顯性(P0.01)。D3和各組間兩兩比力，差異均有明顯性(P0.05)。直線回歸法盤算各組份的I50值。2.2生物堿的純化總生物堿D經(jīng)硅膠層析分散后的4個(gè)組份薄層層析睜開結(jié)果如圖2所示。D3只有一個(gè)斑點(diǎn)，說明層析分散的結(jié)果比力好

6、，可以得到較高純度的生物堿。2.3生物堿的質(zhì)譜闡發(fā)枯燥的待測樣品用色譜純的甲醇溶解。D3的大部門已經(jīng)溶解，離心后仍舊覺察有小部門未溶解，沉淀能完全溶解在三蒸水中。質(zhì)譜結(jié)果如圖3所示。水溶解的質(zhì)譜結(jié)果未表現(xiàn)。阿托品作為參照，經(jīng)校正后的生物堿的分子量為234.33。圖1生物堿分散組份對NE1、NE-2Z細(xì)胞的影響略3討論生物堿是含負(fù)氧化態(tài)氮原子的環(huán)狀化合物，重要漫衍于植物界，在動物中創(chuàng)造的生物堿很少。比年來，越來越多的生物堿在海洋生物中被創(chuàng)造，這些生物堿多數(shù)泉源于海洋，而且都有特異布局和生理活性。生物堿類化合物具有誘導(dǎo)凋亡與按捺凋亡兩方面作用，別離表如今差異的疾病中，尤其在腫瘤方面的研究是如今的熱

7、門6。圖2薄層層析睜開結(jié)果略圖3阿托品(a)和生物堿(b)尺度質(zhì)譜峰圖略前期的動物實(shí)行已經(jīng)證明乙醇粗提物能按捺人低分化鼻咽癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移的底子上，進(jìn)一步的實(shí)行創(chuàng)造海洋泉源的口蛄蝦提取物中醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物均具有顯著按捺人低分化鼻咽癌細(xì)胞系NE1和NE-2Z生長的作用數(shù)據(jù)沒有表現(xiàn)。實(shí)行表白，進(jìn)一步從粗提物分散提取的總生物堿D和純化的單一生物堿D3對兩種細(xì)胞系都表現(xiàn)出精良的按捺作用，并呈時(shí)間-劑量依靠干系。口蛄蝦乙醇粗提物中還含有多種物質(zhì)，有糖類、苷類、卵白多肽等物質(zhì)數(shù)據(jù)沒有表現(xiàn)，那么，組份內(nèi)的別的物質(zhì)是否起作用或和生物堿起協(xié)同作用，仍舊必要進(jìn)一步的實(shí)行來驗(yàn)證。本實(shí)行證明D3具有顯著的抗腫瘤活性，其I50值為80g/l。【參考文獻(xiàn)】1顧帝水,黃培春,孔霞,等.口蝦蛄提取物對人鼻咽癌裸鼠移植瘤生長的影響J.當(dāng)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2022,1414:1826.2孔霞，黃培春，李明勇，等.口蝦蛄抗鼻咽癌活性身分的挑選及其對細(xì)胞周期的影響J.寧夏醫(yī)學(xué)雜志,2022,297:584.3黃全勇，黃巨恩，黃培春.TT法檢測在差異濃度的氫化可的松下腎小管上皮細(xì)胞的活性J.醫(yī)學(xué)文選，2022，24(4):459.4汪茂田,謝培山,王忠東,等.自然有機(jī)化合物提取分散與布局?jǐn)喽?北京:化學(xué)產(chǎn)業(yè)出書社,2022：8.5趙慶春,郭濤,張萍，等.大孔吸