無菌操作技術(shù)二

1、無菌操作技術(shù)無菌：在科學研究和生產(chǎn)實踐中使用的微生物必須是單一的純種或菌株，不能存在雜菌（非目的菌）。無菌操作防止微生物進入機體或物體的方法在微生物操作過程中，除了使用的容器、用具（試管、三角燒瓶、平皿和吸管等）和培養(yǎng)基必須進行嚴格的滅菌處理外，還要通過一定的技術(shù)來保證目的微生物在轉(zhuǎn)移過程中不被環(huán)境中的微生物污染，這些技術(shù)包括用接種環(huán)（針）、吸管、涂棒等工具進行接種、稀釋、涂片、計數(shù)和劃線分離等。實驗?zāi)康?1.學習掌握培養(yǎng)基的配制原理，同時通過對幾種培養(yǎng)基的配制掌握配 制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。 2.了解高壓蒸汽滅菌的原理和應(yīng)用范圍，學習高壓蒸汽滅菌的操作技術(shù)。 3.證實實驗室環(huán)境與人體表面存

2、在微生物，體會無菌操作的重要性。實驗?zāi)康?4.熟練掌握從固體培養(yǎng)物和液體培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)接微生物的無菌操作技術(shù)，熟知各種菌種保藏方法，以及各個方法的特點和區(qū)別。 5.學習并掌握微生物的制片和簡單染色的基本技術(shù)，初步了解細菌的形態(tài)特征。鞏固顯微鏡操作技術(shù)及無菌操作技術(shù)。實驗原理1. 培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水。根據(jù)微生物的種類和實驗?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法。實驗原理2高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸氣急劇

3、地將鍋內(nèi)地冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時，由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點增高，得到高于100攝氏度的溫度。導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的實驗原理3要知道我們周圍存在看得見的微生物可以通過兩種方法：一種是通過放大微生物個體，是我們能夠看到它們；另一種方法是通過“放大”成子細胞群體（菌落），使我們看到它們的存在，即通過培養(yǎng)的方法使肉眼看不見的單個菌體在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過生長繁殖形成幾百萬個菌聚集在一起的肉眼可見的菌落。實驗原理4. 高溫對微生物具有致死效應(yīng)，因此在微生物的轉(zhuǎn)接過程中，一般在火焰旁進行，并用火焰直接灼燒接種環(huán)（針、鏟），以達到滅菌的

4、目的，但一定要保證其冷卻后方可進行轉(zhuǎn)接，以免燙死微生物。如果是轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)物，則用預(yù)先已滅菌的玻璃吸管或吸嘴；如果只取少量而且勿需定量也可用接種環(huán)，視實驗?zāi)康亩ā嶒炘?.通過分離純化得到的微生物純培養(yǎng)物，還必須通過各種保藏技術(shù)使其在一定時間內(nèi)不死亡，不會被其他微生物污染，不會因發(fā)生變異而丟失重要的生物學形狀，否則就無法真正保證微生物研究和應(yīng)用工作的順利進行。保藏菌種的方法包括傳代培養(yǎng)保藏、冷凍保藏和干燥保藏。實驗原理 6.對個體較小的細菌進行制片時采取涂片法，通過涂抹使細胞個體在載玻片上均勻分布，避免菌體堆積而無法觀察個體形態(tài)，通過加熱固定使細胞質(zhì)凝固，使細胞固定在載玻片上，這種加熱處理

5、還可以殺死大多數(shù)細菌而且不破壞細胞形態(tài)。實驗原理7.利用單一燃料對菌體進行染色的方法稱為簡單染色。用于染色的燃料是一類苯環(huán)上帶有發(fā)色基因和助色基因的有機化合物。發(fā)色基因賦予燃料顏色特征，而助色基因使燃料能夠形成鹽。不含助色基因而僅具有發(fā)色基因的苯化合物（色原）即使具有顏色也不能用作燃料，因為它不能電離，不能與酸或堿形成鹽，難以與微生物細胞結(jié)合使其著色。常用的微生物細胞燃料都是鹽，分堿性染料和酸性燃料，前者包括美藍、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、沙黃及孔雀綠等，后者包括酸性復(fù)紅、伊紅及剛果紅等。通常采用堿性燃料進行簡單染色，原因在于微生物細胞在堿性、中性及弱酸性溶液中通常帶負電荷，而燃料電離之后染色部分帶正

6、電荷，很容易與細胞結(jié)合使其著色；當細胞處于酸性條件下所帶正電荷增加時，可采用酸性燃料染色。實驗材料1.牛肉膏，蛋白胨，NaCl，可溶性淀粉，KNO3,K2HPO4.3H2O,MgSO4.7H2O,FeSO4.7H2O,KH2PO4,葡萄糖，孟加拉紅（1%的水溶液），鏈霉素（1%水溶液），1 mol/L NaOH,1mol/L HCL，3%5%石炭酸或2%3來蘇爾溶液，2%的葡萄糖溶液，無菌水，金黃色葡萄球菌24h牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物，草酸銨結(jié)晶紫染液，齊氏石炭酸復(fù)紅染液，呂氏堿性美藍染液，革蘭氏染色用碘液，乳酸石炭酸棉藍染液等。實驗材料2.試管，三角燒瓶，量筒，玻璃棒，培養(yǎng)基分裝器，天平

7、，牛角匙，高壓蒸汽滅菌鍋，PH試紙，棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩，紗布，培養(yǎng)皿，吸管，電熱干燥箱，紫外線燈，注射器，微孔濾膜過濾器，0.22um濾膜，鑷子，玻璃刮棒，滅菌棉簽，試管架，煤氣燈或酒精燈，廢物缸，接種環(huán)，無菌玻璃吸管，吸氣器，載玻片，蓋玻片，顯微鏡，雙層瓶，擦鏡紙，平皿，u型玻棒，滴管，解剖針，解剖刀，生理鹽水，50乙醇，20%甘油 ，高氏一號培養(yǎng)基平板，馬鈴薯瓊脂薄層平板等。實驗步驟一、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 水 1000mL pH 7.47.6實驗步驟1.稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入燒

8、杯中。牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小燒杯或玻璃皿中稱量，用熱水融化后倒入燒杯。也可以放在紙上稱量，稱量后直接放入水中，這時如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。2.融化：在上述燒杯中先加入少許所需要的水量，用玻璃棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，或在磁力攪拌器上加熱溶解。實驗步驟3.調(diào)pH：在未調(diào)pH之前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH，直到pH達到7.47.6。反之，用1mol/L HCl進行調(diào)節(jié)。4.過濾：趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利某些實驗結(jié)果的觀察。一般無特殊要求的情

9、況下，這一步可以省去（本實驗勿需過濾）。實驗步驟5.分裝：按實驗要求，可將配置的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)和三角燒杯內(nèi)。 液體分裝：分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。分裝三角燒瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角燒瓶容積的1/2為宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)，則應(yīng)根據(jù)通氣量的要求酌情減少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，須要補加一定量的無菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準確。 固體分裝：試管分裝，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶的容積的1/2為宜。 半固體分裝：試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。實驗步驟6.加塞：培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上

10、棉塞（或泡沫塑料及試管帽等），以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基而造成污染。7.包扎：加塞后，將全部試管用麻繩捆綁好，再在面塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩包好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配置日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時容易解開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配置日期。實驗步驟8.滅菌：將上述培養(yǎng)基以0.1MPa，121，20min高壓蒸汽滅菌。9.擱置斜面：將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50左右（以防斜面上冷凝水太多）將試管口端擱在玻璃棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長度以不超過試管總長度的一般為宜。10.無菌檢查：將滅菌培養(yǎng)基放在

11、37的溫室中培養(yǎng)2448h，以檢查滅菌是否徹底。實驗步驟二、無菌試驗1.標記分別在兩套平板的底部劃分出四個小區(qū)，并在其邊緣上寫上自己的名字和日期，在四個小區(qū)內(nèi)分別標明待接種的樣品名稱，為了不影響觀察，可用符號或數(shù)字代表。在另外兩套平板的底部，用記號筆寫上姓名、日期以及“空氣1”和“空氣2”。2.人體表面微生物的觀察手指表面：在火焰旁，半開皿蓋，用洗前的手指在平板的A區(qū)域輕輕按一下，迅速蓋上皿蓋。然后用肥皂洗手兩次，自然干燥后，在B區(qū)輕輕按一下，迅速蓋上皿蓋。實驗步驟3.實驗室環(huán)境的檢查將標有“空氣1”的平板在實驗室打開皿蓋，使瓊脂培養(yǎng)基表面完全暴露在空氣中；將另一個標有“空氣2”的平板放在已滅

12、菌的無菌操作箱（室）內(nèi)，打開皿蓋，1h后蓋上兩個皿蓋。取出滅菌濕棉簽，在實驗臺面擦拭約2cm2的范圍，然后將棉簽從平板的開啟出伸進平板表面，在E區(qū)滾動一下，立即閉合皿蓋，放回棉簽。用同樣的方法將擦拭了門旋鈕的棉簽在F區(qū)進行滾動接種，將沾有灰塵的棉簽在G區(qū)接種。將滅菌棉簽在H區(qū)接種。實驗步驟4.培養(yǎng)將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，使皿底朝上，置37培養(yǎng)12d。實驗步驟三、接種（一）、用接種環(huán)轉(zhuǎn)接菌種1.用記號筆分別標記3支肉湯營養(yǎng)瓊脂斜面為A（接菌）、B（接無菌水）、C（非無菌操作）和3支液體培養(yǎng)基為D（接菌）、E（接無菌水）和F（不接種）。2.左手持大腸桿菌斜面培養(yǎng)物，右手持接種環(huán)，將接種環(huán)進行火焰灼燒

13、滅菌(燒至發(fā)紅），然后在火焰旁打開斜面培養(yǎng)物的試管帽（管帽不能放在桌上），并將管口在火焰上燒一下。實驗步驟3.在火焰旁，將接種環(huán)輕輕插入斜面培養(yǎng)物試管的上半部（此時不要接觸斜面培養(yǎng)物），至少冷卻5s后，挑取少許培養(yǎng)物（菌苔）后，再燒一下管口，蓋上管帽并將其放回試管架中。實驗步驟4.用左手迅速從試管架上取出A管，在火焰旁取下管帽，管口在火焰上燒一下，將沾有少量菌苔的接種環(huán)迅速放進A管斜面的底部（接種環(huán)不要碰到試管口邊）并從下至上劃一直線，然后再從其底部開始向上作蛇形劃線接種。完畢后，同樣燒一下管口，蓋上管帽，將接種環(huán)在火焰上灼燒后放回原處。如果是向盛有液體培養(yǎng)基的試管和三角燒瓶中接種，則應(yīng)將挑有

14、菌苔的接種環(huán)首先在液體表面的管內(nèi)壁上輕輕摩擦，使菌體分散從環(huán)上脫開，進入液體培養(yǎng)基中。實驗步驟5.按上述方法從盛有無菌水的試管中取一環(huán)無菌水于B管中，同樣劃線接種。6.以非無菌操作為對照：在無酒精燈或煤氣燈的條件下，用未經(jīng)滅菌的接種環(huán)從另一盛有無菌水的試管中取一環(huán)水劃線接種到C管中。上述無菌操作技術(shù)也可將待接和被接的2支試管同時拿在左手上進行。實驗步驟（二）、用吸管轉(zhuǎn)接菌液1.輕輕搖動盛菌液的試管（不要濺到管口或管帽上），暫放回試管架上。2.從已滅菌的吸管筒中取出一支吸管，將其插入吸氣器下端，然后按無菌操作要求，將吸管插入已搖勻的菌液中，吸取0.5ml菌液并迅速轉(zhuǎn)移至D管中。3.取下吸氣器，將

15、用過的吸管放入廢物筒中。筒底必須墊有泡沫塑料等軟墊，以防吸管嘴破損。4.換另一支無菌吸管，按上述同樣方法從盛無菌水的試管中吸取吸取0.5ml菌液轉(zhuǎn)移至E管中。在使用吸管操作過程中，手指不要接觸其下端。實驗步驟五、細菌制片及簡單染色1.涂片取一塊載玻片，用記號筆平均分為兩個區(qū)域并標記；各滴一小滴生理鹽水于兩個區(qū)域中央；用接種環(huán)無菌操作分別由枯草芽孢桿菌營養(yǎng)瓊脂斜面和金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂斜面挑取適量菌苔，將沾有菌苔的接種環(huán)置于載玻片的生理鹽水中涂抹，使菌懸液在載玻片上形成均勻薄膜。若用液體培養(yǎng)基涂片，可用接種環(huán)蘸取12環(huán)菌液直接涂于載玻片上。實驗步驟2.干燥自然干燥或用電吹風干燥。3.固定涂菌面

16、朝上，通過火焰23次。4.染色將載玻片平放于載玻片支架上，滴加染液覆蓋涂菌部位即可，呂氏堿性美籃1.5min，草酸銨結(jié)晶紫染液或齊氏石炭酸復(fù)紅染液1min。5.水洗傾去染液，自來水沖洗，水流不宜過急、過大，勿直接沖涂片處，至洗出無色水為止。實驗步驟6.干燥用吸水紙吸去多余水分，自然干燥或用電吹風干燥。7.鏡檢將制備好的樣片置于顯微鏡下進行觀察、記錄。實驗結(jié)果注意事項1.要嚴格按配方配制。2.調(diào)pH不要過頭。3.高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱后排除冷空氣，到時降壓回零取物。4無菌操作需要在火焰旁進行，因此，在操作時要小心，不要將手燙傷。5.禁止用嘴吸取菌液6.用接種環(huán)將菌體與染液混合時不要劇烈

17、涂抹，以免破壞細胞。7.滴加染液要適中，否則用蓋玻片覆蓋時，染液過多會溢出，過少會產(chǎn)生大量氣泡。8.蓋玻片要緩慢傾斜覆蓋，以免產(chǎn)生氣泡。思考因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。1. 高壓蒸汽滅菌開始之前為什么要將鍋內(nèi)的冷空氣排盡？思考首先要記?。簺]有一種條件或培養(yǎng)基能使所有的微生物生長。本實驗中所用的培養(yǎng)基是一種豐富培養(yǎng)基，可以支持大量不同的微生物生長，因此可以滿足本實驗的要求

18、。2.為什么用肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基？思考答：防止菌種污染環(huán)境，違背無菌操作技術(shù)原則。3. 為什么接種完畢后，接種環(huán)還必須灼燒后再放回原處，吸管也必須放進廢物筒中？思考答：1.產(chǎn)生的高溫可以消滅細胞，避免細胞交叉污染 2.火焰的溫度能夠使氣流形成負壓，在酒精燈周圍10cm處形成一個無菌區(qū)。4. 為什么酒精燈外焰可以形成無菌區(qū)域小結(jié)1.獲得試驗成功的關(guān)鍵牢固樹立無菌概念，細心、認真體會無菌操作的要領(lǐng)。2.了解掌握不同菌落形態(tài)細菌細菌是原核微生物，故形成的菌落也小；細菌個體之間充滿著水分，所以整個菌落顯得濕潤，易被接種環(huán)挑起；球菌形成隆起的菌落；有鞭毛細菌常形成邊緣不規(guī)則的菌落；具有莢膜的菌落表面較透明，邊緣光滑整齊；有芽孢 的菌落表面干燥皺褶；有些能產(chǎn)生色素的細菌菌落還顯出鮮艷的顏色。較難挑起。霉菌常呈絨毛狀、絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀，有時還能呈紅、褐、綠、黑、黃等不同顏色酵母菌大多數(shù)酵母菌的