體內(nèi)藥物分析 手性藥物HPLC法

1、2021/9/131第10章 手性藥物的 高效液相色譜拆分法 空間結(jié)構(gòu)不能重疊，互為鏡像關(guān)系的立體異構(gòu)體為對映體異構(gòu)體，簡稱對映體（enantiomer），相應(yīng)的藥物稱為手性藥物。第一節(jié)、概述P 2702021/9/132 偏振光和比旋光度 光是一種電磁波，光波的振動方向與光的前進方向垂直。 如果讓光通過一個象柵欄一樣的 Nicol 棱鏡 (起偏鏡)就不是所有方向的光都能通過，而只有與棱鏡晶軸方向平行的光才能通過。這樣，透過棱晶的光就只能在一個方向上振動，象這種只在一個平面上振動的光，稱為平面偏振光，簡稱偏振光或偏光。 2021/9/133 那么，偏振光能否透過第二個Nicol 棱鏡 (檢偏鏡

2、) 取決于兩個棱鏡的晶軸是否平行，平行則可透過；否則不能通過。如果在兩個棱鏡之間放一個盛液管，里面裝入兩種不同的物質(zhì)：2021/9/134結(jié)論： 物質(zhì)有兩類： （1）旋光性物質(zhì)能使偏振光振動面旋轉(zhuǎn)的性質(zhì)，叫做旋光性；具有旋光性的物質(zhì)，叫做旋光性物質(zhì)。 （2）非旋光性物質(zhì)不具有旋光性的物質(zhì)，叫做 非旋光性物質(zhì)。 旋光性物質(zhì)使偏振光旋轉(zhuǎn)的角度，稱為旋光度，以“”表示。2021/9/135 旋光儀 polarmeter： 定量測量液體或溶液的旋光程度的儀器 在有機化學(xué)中，凡是手性分子都具有旋光性，而非手性分子則沒有旋光性。2021/9/136C*不對稱碳原子不對稱碳原子: (asymmetric c

3、arbon atom)與四個互不相同的基團相連的碳原子叫不對稱碳原子 C. 飽和碳原子具有四面體結(jié)構(gòu). (sp3雜化)2021/9/137具有鏡像與實物關(guān)系的一對旋光異構(gòu)體。 對映異構(gòu)體 (S)-(+)-乳酸 (R)-(-)-乳酸 ()-乳酸 mp 53oC mp 53oC mp 18oC D=+3.82 D=-3.82 D=0 pKa=3.79(25oC) pKa=3.83(25oC) pKa=3.86(25oC)151515外消旋乳酸比旋光度2021/9/138對映體的命名 RS命名原則（1）按次序規(guī)則排出各取代基的順序ABCD原子序數(shù)大小規(guī)則序數(shù)大的原子優(yōu)先同位素規(guī)則原子量大優(yōu)先外推規(guī)則

4、層層外推，先比較最大的d. 相當(dāng)規(guī)則重鍵看作多個單鍵如：C=C2 等（2）方向盤法： 最小基團D放在操作桿上， 從D的對面看，順時針為R,反時針為S.藥物分子的手性標記通常采用R/S序列標記法。2021/9/139 手性藥物的現(xiàn)狀（現(xiàn)代藥物分析選論，安登魁）手性藥物（579）藥物（1992）天然和半合成藥物（556）合成藥物（1436）非手性藥物（857）單一異構(gòu)體（73）外消旋體（506）手性藥物（547）非手性藥物（9）單一異構(gòu)體（537）外消旋體 （10）2021/9/1310 同時，手性也是生物體系的基本特征。人體內(nèi)糖的構(gòu)型為D-構(gòu)型，氨基酸為L-構(gòu)型，因此，內(nèi)源性的大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)

5、、酶、載體、受體、糖蛋白、多糖、核酸等都具有手性特征。手性藥物的作用機制： 從立體化學(xué)角度看，手性藥物的2個對映體實際上是2種完全不同的藥物。它們通過與體內(nèi)大分子的不同立體結(jié)合，可產(chǎn)生不同的吸收、分布、代謝和排泄過程，從而導(dǎo)致藥物動力學(xué)參數(shù)的變化。由于手性藥物的兩個對映體的體內(nèi)藥動學(xué)過程不同，而可能具有不同的藥理和毒理作用，甚至藥效拮抗，也可能其中一個對映體導(dǎo)致了藥物不良反應(yīng)。？反應(yīng)停不良反應(yīng)？(S)-thalidomide 致畸2021/9/1311 手性藥物的藥理作用是通過與體內(nèi)大分子之間的嚴格手性匹配與分子識別而實現(xiàn)的，也就是在人體內(nèi)藥物通過與具有特定物理形態(tài)的受體反應(yīng)起作用。藥物的兩種

6、立體異構(gòu)體中，只有一種更適合與受體或活性部位結(jié)合，從而抑制（或激動）該大分子的生理活性，達到治療的目的。藥效2021/9/1312 手性藥物與生物體系相互作用具有立體選擇性，可引起藥理學(xué)差異，即藥理學(xué)立體選擇性。藥理學(xué)立體選擇性分為藥效學(xué)立體選擇性(stereoselectivity in pharmacodynamics)和藥代動力學(xué)立體選擇性(stereoselectivity in pharmacokine-tics)。宮麗 綜述2021/9/1313手性藥物光學(xué)異構(gòu)體的藥理作用大致有以下5種類型：一種光學(xué)異構(gòu)體無治療活性。生物活性強度不同的光學(xué)異體。生物活性強度相等的光學(xué)異構(gòu)體。生物活

7、性類型不同的光學(xué)異構(gòu)體。生物活性相反的光學(xué)異構(gòu)體。2021/9/1314反應(yīng)停所引起的不良反應(yīng)2021/9/1315(S)-thalidomide 致畸(R)-thalidomide 鎮(zhèn)靜FDA (U.S. Food & Drug Administration) To patent new drugs needs full documentation of the pharmacological profiles of the individual enantiomers as well as their combinations. 1984年荷蘭藥理學(xué)家Ariens極力提倡手性藥物以單一對映

8、體上市，抨擊以消旋體形式進行藥理研究以及上市。他的一系列論述的發(fā)表，引起藥物部門廣泛的重視。2021/9/1316 美國FDA 1992發(fā)布了手性藥物指導(dǎo)原則。要求所有在美國上市的消旋體類新藥，生產(chǎn)者均需提供報告，說明藥物中所含的對映體各自的藥理作用、毒性和臨床效果。歐共體國家及日本、加拿大等國隨后也規(guī)定了類似的法規(guī)。2006年1月，我國SFDA也出臺了相應(yīng)的政策法規(guī)。這意味著化合物中如果存在一個手性中心，申請消旋藥物時至少得做3組藥理、臨床數(shù)據(jù)，無疑研究費用和工作量相應(yīng)加大。如果開發(fā)的是光學(xué)純的手性藥，只需做一組試驗即可。隨著拆分技術(shù)和不對稱合成技術(shù)的發(fā)展，選擇光學(xué)純藥物開發(fā)要更合算一些。

9、2021/9/1317 自從1992年美國FDA開始要求手性藥物以來，手性藥物在研發(fā)的新藥中所占比例逐年增加，據(jù)市場統(tǒng)計1993年單一對映體藥物的銷售額為350億美元，2000年全球銷售額達到1 330億美元，預(yù)計2008年達到2 000億美元。 手性藥物以單純對映體形式上市，可減少治療總劑量，減少藥物間相互作用，消除無活性對映體的毒性。 合成手性藥物的方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法兩種。2021/9/1318 上世紀60年代初，科學(xué)家們開始研究在極少量的手性催化劑作用下獲得大量的單旋體，這就是手性合成技術(shù)。最初只獲得了3%的收率，經(jīng)過近三十年的努力終于獲得了成功。目前最高的產(chǎn)率已經(jīng)接近10

10、0%，特別需要指出的是這種技術(shù)可以使人們隨心所欲地合成自然界中不存在的左旋體或右旋體。 比如除草劑Metolachlor，其左旋體具有非常高的除草性能，而右旋體不僅沒有除草作用，而且具有致突變作用，每年有2000多萬噸投放市場，其中1000多萬噸是環(huán)境污染物。Metolachlor自1997年起以單旋體上市，10年間少向環(huán)境投放約1億噸化學(xué)廢物。2021/9/1319 因此，若以消旋體藥物給藥，在研究藥物對映體的藥效、毒性及藥動學(xué)性質(zhì)時，應(yīng)分別對單個光學(xué)異構(gòu)體進行測定。如果采用傳統(tǒng)、非立體選擇性藥物分析方法測定生物體液中藥物對映體，以評價其藥理行為，會得出不全面甚至錯誤的結(jié)論。所有這些都要求建

11、立高專屬性、高靈敏度、高分離度的對映體拆分和測定方法。2021/9/1320 對映體化合物之間除了偏振光的偏轉(zhuǎn)方向不同外，其他理化性質(zhì)完全相同，因而在非手性環(huán)境中基本無法分離。 創(chuàng)造手性環(huán)境，構(gòu)造非對映異構(gòu)體是實現(xiàn)手性拆分的基礎(chǔ)色譜法分離手性藥物對映體的方法有：間接法直接法 手性固定相法 CSP 手性流動相法 CMP創(chuàng)造手性環(huán)境構(gòu)造非對映異構(gòu)體2021/9/1321第二節(jié) 手性分析的方法一、間接法 又稱柱前衍生化法，是藥物對映體（不能說外消旋體）在用HPLC分離前，先與具有高光學(xué)純度的手性衍生化試劑（CDR）反應(yīng)，在藥物對映體中引入第二個手性中心，形成非對映異構(gòu)體，其理化性質(zhì)就有較大的差異，因

12、而可在普通固定相（非手性固定相）上實現(xiàn)分離 （R）SE + (R) SA (R)SE(R) SA (S) SA (R)SE(S) SA2021/9/13221.衍生化反應(yīng)注意事項：（1）手性試劑必須是高光學(xué)純度試劑，同時為了保證分析方法的準確性，衍生化反應(yīng)需定量完成（90-100%）（2）手性待測物必需具有可反應(yīng)的活潑基團如氨基、醇基、羧基，以保證與CDR反應(yīng)完全。（3）手性試劑及反應(yīng)產(chǎn)物在化學(xué)上和手性上都要穩(wěn)定 （4）所生成的非對映體在色譜分離時應(yīng)有較高的柱效（5）在選擇手性衍生化試劑時，應(yīng)同時考慮使生成的非對映異構(gòu)體具有良好的檢測特性，故手性試劑應(yīng)具有紫外或熒光等可檢測基團。2021/9/

13、13232.常用衍生化試劑的種類（1）異硫氰酸酯（ITC）、異氰酸酯(IC)類 此類試劑易與大多數(shù)醇類和胺類化合物反應(yīng)，形成相應(yīng)的氨基甲酸酯或脲的非對映體。如麻黃堿類、腎上腺素類、腎上腺素拮抗劑、兒茶胺類等。（2）萘衍生物類 其結(jié)構(gòu)特征有利于提高立體選擇性，同時此類化合物具有很強的紫外吸收，用UV檢測器可大大提高檢測靈敏度，因此，萘的衍生物用作CDR十分普遍。2021/9/1324（3）羧酸衍生物類 主要包括酰氯與磺酰氯類、酸酐類和率甲酸酯類。它們的手性碳位于羧基的位，可與胺、氨基酸及醇類藥物反應(yīng)生成非對映異構(gòu)體衍生物。（4）胺類 主要用于衍生化羧酸類、N-保護氨基酸、醇類藥物（5）測定體液中

14、低濃度的藥物對映體時，采用高靈敏度的熒光CDR2021/9/1325手性衍生化法的特點優(yōu)點只需使用價格便宜、柱效較高的非手性柱衍生化可提高靈敏度缺點需要柱前衍生化，操作復(fù)雜衍生化試劑要求高的光學(xué)純度衍生化反應(yīng)速率重現(xiàn)性較差2021/9/1326柱前衍生化-反相高效液相色譜法 拆分酮洛芬對映異構(gòu)體S-()-酮洛芬 R-(-)-酮洛芬 2021/9/1327酮洛芬對映體的柱前衍生化示意圖 S-萘乙胺2021/9/1328酮洛芬對映體的柱前衍生化方法酮洛芬對照品溶液(1 mg/mL)0.1 mL加入正己烷0.6 mL二氯亞砜溶液0.2 mL751 h冷卻至室溫吹干后加入S-NEA溶液0.2 mL5

15、min振搖加入2.0 mol/L H2SO4 0.5 mL混勻吹干后溶解進樣二氯甲烷:乙醚2:12021/9/1329色譜條件色譜柱：Hypersil C18, 5 m, 1505.0 mm ID， 流動相：乙腈水-乙酸-三乙胺(55 : 45 : 0.1 : 0.02，v/v)，流速： 1 ml/min, 檢測波長：254 nm2021/9/1330酮洛芬對映體衍生化物色譜圖RS酮洛芬對映體衍生化物的保留時間為tR=7.3 min，tR=8.5 min，分離度為1.92021/9/1331二、直接法 是在HPLC系統(tǒng)中引入“手性識別器”或手性環(huán)境，以形成暫時的非對映異構(gòu)體復(fù)合物，根據(jù)其形成復(fù)

16、合物的穩(wěn)定系數(shù)不同而獲得分離。理論基礎(chǔ)： Dalgliesh于1952年“三點相互作用”（three-point interaction)理論，在一對對映體和手性選擇劑之間，為了形成穩(wěn)定性不同的非對映體分子絡(luò)合物而達到手性分離的目的，至少需要三個分子之間的相互作用部位，其作用力包括氫鍵相互作用包結(jié)絡(luò)合作用-電荷轉(zhuǎn)移相互作用立體契合作用過渡金屬離子的手性配位相互作用。2021/9/1332提供手性環(huán)境，通過手性識別進行分離2021/9/1333（一）手性流動相法 CMP 在流動相加入手性添加劑（CMPA），使其與待測物形成非對映異構(gòu)體復(fù)合物，根據(jù)其形成復(fù)合物的穩(wěn)定常數(shù)的不同而得以分離。直接法常用

17、的手性添加劑環(huán)糊精添加劑手性離子對試劑配基交換型手性添加劑2021/9/13341.環(huán)糊精添加劑（一）手性流動相法 CMPcyclodextrins，CD可分為、三類，它們分別由6，7，8個D-吡喃葡萄糖通過-1，4羥基連接。每個葡萄糖單元有5個手性碳原子。 CD的手性識別主要來自環(huán)內(nèi)腔對芳烴或脂肪烴側(cè)鏈的包容作用及環(huán)外殼上的羥基與藥物對映體發(fā)生氫鍵作用。-CD及其改性CD因具有最佳大小的內(nèi)腔，因而廣為使用2021/9/13352.手性離子對色譜法（一）手性流動相法 CMP 是一類用于分離可解離對映體的離子對色譜法，已成功分離了-氨基醇類、氨基醇類、胺類等對映體化合物。常用手性反離子有奎尼，奎

18、尼丁、10-樟腦磺酸等。 3.配基交換型手性添加劑在流動相緩沖溶液中加入金屬離子和配位體交換劑形成二元絡(luò)合物，藥物對映體再與其形成穩(wěn)定性不同的三元絡(luò)合物而達到手性分離。常用手性配基為光學(xué)活性氨基酸及其衍生物的二價金屬離子螯合物。它們 和手性藥物形成非對映異構(gòu)配位絡(luò)合物對。2021/9/1336特點可采用普通的非手性固定相不需對樣品進行衍生化手性添加物的可變范圍較寬2021/9/1337 -環(huán)糊精手性流動相添加劑法拆分佐匹克隆對映體徐穎 藥學(xué)進展 2006 第9期佐匹克?。▃opiclone）是第三代吡咯酮類速效催眠藥色譜柱：Zorbax Rx C18柱（ 4.6x250mm，5 m）；流動相為

19、0.12mol/L的磷酸鹽緩沖液-甲醇（7525，V/V），其中含9 mmol/L 的-環(huán)糊精；PH6.0，流速為0.8ml/min；檢測波長305 nm；進樣量20L；柱溫為20。2021/9/1338 手性固定相是在色譜柱的擔(dān)體上加上高光學(xué)純度的手性異構(gòu)體制作而成。采用手性固定相的HPLC法可以直接、快速、有效、簡便地分離大多數(shù)手性物質(zhì)對映體。直接法（二）手性固定相法 CSP目前，以商品出售的手性固定相有100種左右但手性柱極其昂貴2021/9/13391.電荷轉(zhuǎn)移型手性固定相（小分子型）手性固定相 是指分子中具有吸電子基團（如硝基）或斥電子基團（如氨基、烷基、烷氧基、萘環(huán)）并且能夠與對映

20、體發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移作用而達到拆分目的的一類手性固定相。 Pirkle 型手性固定相是目前使用量大、適用面廣、對手性識別機理揭示較深的一類重要CSP。這類固定相研究主要貢獻應(yīng)歸功于美國Illinois大學(xué)的Pirkle W H 研究組，故稱Pirkle 型手性固定相 -堿型（有斥電子取代基）Pirkle 型手性固定相：拆分大量-酸的胺、氨基酸、亞砜類等對映體。 -酸型（有吸電子取代基）Pirkle 型手性固定相：拆分多種帶烷基、醚基、氨基取代的芳香環(huán)類對映體。2021/9/1340常用的有：牛血清蛋白（BSA）和人血1-酸性糖蛋白(AGP)鍵合硅膠手性固定相2. 蛋白質(zhì)類手性固定相手性固定相 蛋白質(zhì)

21、是一類高分子聚合物，所含L-氨基酸具有手性特異性，可與藥物對映體在蛋白質(zhì)結(jié)合位點進行手性識別而達到分離。此類鍵合相以離子鍵或共價鍵以及蛋白交聯(lián)作用將蛋白質(zhì)固定到硅膠上。 此類固定相的應(yīng)用范圍較廣，拆分效果好，但其色譜柱容量小；常用的流動相為磷酸鹽緩沖液pH4-7，離子強度為0-500mmol/L，有機改性劑不得超過5%。2021/9/1341手性固定相3.多糖及其衍生物類手性固定相 每個葡萄糖單元含有5個手性中心，以及一個伯羥基和2個仲羥基，通過對其化學(xué)改性可以得到一系列衍生物。 多糖及其衍生物類手性固定相可細分為纖維素衍生物類、纖維素氨基甲酸酯類及直鏈淀粉類 此類固定相的優(yōu)越之處在于：良好的穩(wěn)定性，制柱簡單，無需鍵合，適用于多種手性藥物的拆分。2021/9/1342手性固定相4.環(huán)糊精類手性固定相 將環(huán)糊精或其衍生物通過共價鍵鍵合到載體上便得到環(huán)糊精手性固定相5.大環(huán)類抗生素手性固定相 大環(huán)類抗生素為多手性中心、多官能團的化合物，可通過多種屬性識別機制進行識別，是一種高效的手性選擇固定相。 大環(huán)抗生素具有疏水作用、偶極-偶極作用、-作用、氫鍵作用、和立體排阻作用，常用于手性拆分的大環(huán)抗生素主要有糖肽類、安莎霉素類、氨基糖苷抗生素2021/9/1343手性固定相 6.冠醚類手