CIMT促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能康復(fù)的分子機(jī)制的研究課件

1、強(qiáng)制性運(yùn)動(dòng)療法促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能康復(fù)分子機(jī)制的研究張 璇濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院前 言腦梗死 ( cerebral infarction) 是一種發(fā)病率、死亡率和致殘率均較高的疾病，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。雖然超早期溶栓治療效果好 ，但大部分病人受時(shí)間窗限制而失去了溶栓時(shí)機(jī) ，神經(jīng)功能缺失不可避免，總會(huì)遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙，如偏癱、失語(yǔ)等。由于神經(jīng)系統(tǒng)具有很強(qiáng)的可塑性，后期的神經(jīng)功能康復(fù)顯得非常重要。 強(qiáng)制性運(yùn)動(dòng)療法 （congstraint-induced movement therapy CIMT）是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性為基礎(chǔ)，發(fā)展起來(lái)的一種康復(fù)治療技術(shù)。 CIMT的基

2、本概念是在生活環(huán)境中通過(guò)限制患者使用健側(cè)肢體，達(dá)到強(qiáng)制反復(fù)使用和強(qiáng)化訓(xùn)練患肢為目的的療法。神經(jīng)影像學(xué)研究及臨床應(yīng)用研究均顯示CIMT有顯著促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)的作用。但其確切的作用機(jī)制還不十分清晰。立題目的和意義探討CIMT促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能康復(fù)的分子機(jī)制 ，從而為臨床該療法的廣泛應(yīng)用推廣提供理論指導(dǎo)。材料與方法1材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 120只SD大鼠，體重（26050）g，雌雄不拘，實(shí)驗(yàn)期間定期檢測(cè)大鼠心率、血壓、呼吸并維持于正常范圍。大鼠術(shù)前12h禁食，自由飲水。1.3 動(dòng)物模型制備：大鼠自體血栓栓塞大腦中動(dòng)脈局灶腦缺血模型的制備，選用SD大鼠，體重230350g, 用大鼠自體血制成直徑為0

3、.35mm的血栓，切成1.52mm長(zhǎng)，用麻醉導(dǎo)管將58個(gè)栓子注入一側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，使其堵塞大腦中動(dòng)脈起始部，建立大腦中動(dòng)脈閉塞局灶腦缺血模型。假手術(shù)組只分離血管不注入血栓1.4 強(qiáng)制性使用運(yùn)動(dòng)療法干預(yù)80只腦缺血模型成功大鼠，1W時(shí)給予進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，隨機(jī)分2組（即對(duì)照組和CIMT組），CIMT組大鼠用 10%水合氯醛麻醉，將健康的一側(cè)前肢置于自然屈曲位置，用手術(shù)縫線將皮膚縫在一段3 厘米長(zhǎng)的鐵絲上（鐵絲尾端與繞在胸部的鐵環(huán)相連），然后用石膏纏繞固定該肢體，部分限制其肢體活動(dòng)，固定后仍飼養(yǎng)于原籠中。手術(shù)后第 8W解除固定。 1.5.1 石蠟切片制備：每組在1W、2W、4W、8W各時(shí)間點(diǎn)，分別

4、隨機(jī)取2只大鼠，局部麻醉后經(jīng)2.5%的戊二醛固定后，斷頭取腦。用鋒利刀于病灶邊緣取腦組織（各標(biāo)本取材部位大致相同），0.51mm3的3小塊。經(jīng)再固定、梯度酒精脫水、丙酮、環(huán)氧丙烷、環(huán)氧樹(shù)脂包埋后，進(jìn)行超薄切片。1.5.2 電鏡超薄切片制備： 每組在1W、2W、4W、8W各時(shí)間點(diǎn)，分別隨機(jī)取2只大鼠，局部麻醉后經(jīng)2.5%的戊二醛固定后，斷頭取腦。用鋒利刀片于病灶邊緣取腦組織（各標(biāo)本取材部位大致相同）0.51mm3的3小塊。經(jīng)戊二醛再固定、梯度酒精脫水、丙酮、環(huán)氧丙烷浸透、環(huán)氧樹(shù)脂包埋后，進(jìn)行超薄切片1.5.3 免疫印跡腦組織取材每組在1W、2W、4W、8W各時(shí)間點(diǎn)，分別隨機(jī)取3只大鼠，局部麻醉后

5、經(jīng)以 4生理鹽水進(jìn)行灌洗，斷頭取腦，迅速取缺血側(cè)大腦皮層及缺血灶邊緣各200mg 腦組織備用2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 每組在1W、2W、4W、8W各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，參照改良的Bederson氏6級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 進(jìn)行評(píng)分。2.2 電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)變化2.3.1原位雜交及免疫組化結(jié)果觀察原位雜交及免疫組化結(jié)果，經(jīng)常規(guī)染色、封片后，自然晾干，結(jié)果在40倍物鏡下觀察每張切片陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，經(jīng)td2000圖像處理系統(tǒng)分析處理，采集圖像輸入計(jì)算機(jī)，,以灰度計(jì)算所選視野陽(yáng)性染色的單位面積(陽(yáng)性細(xì)胞的的面積占所選整個(gè)視野面積的百分比),每張切片取梗死灶邊緣區(qū)互不重疊的5個(gè)視野，其均值即為該標(biāo)本每個(gè)高倍鏡

6、視野中陽(yáng)性細(xì)胞的單位面積。2.3.2免疫印跡結(jié)果分析采用2200 凝膠圖像分析儀，于可見(jiàn)光下采集底片上的蛋白條帶圖像，通過(guò)與相應(yīng) -actin 條帶密度比較，計(jì)算每個(gè)條帶密度相對(duì)值。2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，運(yùn)用spss10.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包分析，采用單因素方差分析oneWayANOVY方法統(tǒng)計(jì)，其中兩兩比較采用Student-Newman-keuls方法，顯著性水平為0.05。3.結(jié) 果 結(jié)果 3.1 CIMT對(duì)大鼠腦缺血后神經(jīng)功能缺損的影響大鼠腦缺血模型術(shù)后7d，CIMT組和對(duì)照組Bederson評(píng)分比較無(wú)顯著性差異(P0.05),與假手術(shù)組比較，差異明顯（P0.0

7、1）。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組神經(jīng)功能缺損癥狀都逐漸減輕。CIMT神經(jīng)功能改善較對(duì)照組顯著(P0.01)。3.2超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果超微結(jié)構(gòu)觀察 缺血1W時(shí)對(duì)照組缺血邊緣區(qū)大量膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元受損，細(xì)胞內(nèi)外水腫，核膜結(jié)構(gòu)破壞，核內(nèi)異染色質(zhì)增多、聚集，毛細(xì)血管、軸突水腫，線粒體腫脹，突觸解體，數(shù)目減少。殘存突觸結(jié)構(gòu)腫脹明顯，突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜特化帶結(jié)構(gòu)模糊，分界不清，在突觸前成分內(nèi)散在分布結(jié)構(gòu)不完整的囊泡，突觸連接帶明顯變短，突觸間隙變窄; 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在2W、4W、8W時(shí)上述病理改變逐漸減輕，突觸數(shù)量有所增加，可見(jiàn)新生突觸，4W時(shí)超微結(jié)構(gòu)CIMT組超微結(jié)構(gòu)觀察CIMT組經(jīng)治療在第2W、4

8、W、8W觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)其缺血邊緣區(qū)突觸結(jié)構(gòu)損傷程度較對(duì)照組明顯減輕，突觸數(shù)目減少較對(duì)照組少，新生突觸明顯增多，見(jiàn)圖10。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這種效果愈加明顯。4W時(shí)超微結(jié)構(gòu)CIMT對(duì)NgR mRNA表達(dá)的影響 CIMT對(duì)NgR 蛋白表達(dá)的影響 CIMT對(duì)NgR mRNA及蛋白表達(dá)的影響與假手術(shù)組比較，在第一周對(duì)照組及CIMT缺血灶邊緣腦組織及同側(cè)皮質(zhì)中NgR mRNA及蛋白表達(dá)明顯增多。隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組及CIMT缺血灶邊緣腦組織及同側(cè)皮質(zhì)中NgR mRNA及蛋白表達(dá)逐漸減少。與對(duì)照組比較，CIMT組缺血灶邊緣腦組織及同側(cè)皮質(zhì)中NgR mRNA及蛋白表達(dá)減少程度更顯著（0.01）。CIMT對(duì)BD

9、NF mRNA及蛋白表達(dá)的影響 CIMT對(duì)BDNF mRNA表達(dá)的影響 CIMT對(duì)BDNF 蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，在第一周對(duì)照組及CIMT缺血灶邊緣腦組織及同側(cè)皮質(zhì)中BDNF mRNA及蛋白表達(dá)明顯增多。隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組缺血灶邊緣腦組織及同側(cè)皮質(zhì)中BDNFmRNA及蛋白表達(dá)逐漸減少，而CIMT在觀察點(diǎn)第2W、4W時(shí)（即治療1W、3W后）其缺血灶邊緣腦組織及同側(cè)皮質(zhì)中BDNF mRNA及蛋白表達(dá)較觀察點(diǎn)第1W時(shí)明顯增加，觀察點(diǎn)第8W時(shí)逐漸下降，但與對(duì)照組比較有顯著變化見(jiàn)表3（0.01）。CIMT對(duì)GAP-43 mRNA表達(dá)的影響 各組大鼠腦組織在4W時(shí)GAP-43的表達(dá) 假手術(shù)組 對(duì)照組 CIMT組CIMT對(duì)GAP-43 蛋白表達(dá)的影響 CIMT對(duì)SYPmRNA表達(dá)的影響 各組大鼠腦組織在4W時(shí)SYP的表達(dá) 假手術(shù)組 對(duì)照組CIMT組 結(jié) 論1、強(qiáng)制性使用運(yùn)動(dòng)療法可明顯降低腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損程度，減低腦梗塞的致殘率2、強(qiáng)制性使用運(yùn)動(dòng)療法通過(guò)降低NgR的表達(dá)，促進(jìn)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子BDNF的表達(dá)，減少對(duì)神經(jīng)再生的阻滯，促進(jìn)神經(jīng)軸突發(fā)芽、建立側(cè)枝反射，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。3、強(qiáng)制性使用運(yùn)動(dòng)療法通過(guò)促進(jìn)大鼠腦梗死后缺血邊緣區(qū)及大腦皮層GAP43和SYP的表達(dá)，具有促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)、突觸再生和重建、完善突觸效能的作用，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。結(jié) 語(yǔ)通過(guò)本課