雪靈芝提取物對體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性的影響

1、雪靈芝提取物對體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性的影響【摘要】目的討論雪靈芝提取物對體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性的影響。方法以人肝L-02細(xì)胞作為研究對象，用四環(huán)素建立肝細(xì)胞脂肪變性模型。將實(shí)驗(yàn)分為誘導(dǎo)組，繼續(xù)誘導(dǎo)組、脫離誘導(dǎo)組，用油紅染色觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成情況，并測定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量的變化。結(jié)果雪靈芝提取物(2060gl-1)可明顯降低細(xì)胞內(nèi)TG值，并呈劑量依賴性。結(jié)論雪靈芝提取物通過減少細(xì)胞內(nèi)TG的生成從而阻止肝細(xì)胞脂肪變性?！娟P(guān)鍵詞】雪靈芝;四環(huán)素;甘油三酯Abstrat：bjetiveTstudytheeffetsfArenariakansuensisextrats(AKS)nhe

2、patytesteatsisinduedbytetraylineinvitr.ethdsSteatsisdelfhepatytesestablishedbyaddingtetraylinetthegringL-02ellstrain.Lipiddrpletsinthehepatyteserebservedbyilredstainingandthententftriglyeride(TG)inhepatytesaseasuredithanalyzedkit.ResultsAKS(2060gl-1)nentratindependentlydereasedthelevelfTGinhepatytes

3、.nlusinAKSanpreventhepatytefattydegeneratinviainhibitingTGprdutin.Keyrds：Arenariakansuensis(AKS);Tetrayline;TG非酒精性脂肪肝(nn-alhlifattyliverdisease,NAFLD)是一種無過量飲酒史(每周飲酒折合酒精量小于40g)、以肝本質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪儲積為特征的臨床病理綜合征1。隨著人民物質(zhì)生活程度的進(jìn)步，生活方式和飲食構(gòu)造發(fā)生了顯著的改變，再加上科學(xué)技術(shù)的飛躍開展，發(fā)現(xiàn)和被檢測到的NAFLD患者逐年升高。由于NAFLD是肝硬化、肝癌的重要病因2，3，所以對其進(jìn)展深化

4、地研究具有非常重要的意義。雪靈芝(Arenariakansuensis，AKS)系石竹科蚤綴屬多年生草本植物，藏藥名為阿仲嘎保，分布于西藏、青海、四川、甘肅，是一種極為珍貴的藏藥資源，有悠久的藥用歷史4。以全草入藥，性味甘寒，有清熱解毒、利膽退黃、通淋止痛的作用，主治流感、黃疸、肺炎、筋骨疼痛、淋病等，還具有抗缺氧成效5和對酒精性肝損傷有保護(hù)作用6。本實(shí)驗(yàn)研究了雪靈芝提取物對四環(huán)素誘導(dǎo)的脂變細(xì)胞的影響，為進(jìn)一步開發(fā)雪靈芝保健產(chǎn)品提供理論根據(jù)。1材料與儀器1.1儀器2培養(yǎng)箱(美國FrasientifiIn公司)，倒置顯微鏡(日本lypus公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀del-450(美國Bi-Rad公司

5、)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52型，上海亞榮儀器廠消費(fèi))。1.2試劑雪靈芝，由西藏阿仲嘎保生物制品提供;1640培養(yǎng)液購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京);血清購自?？寺∩锘瘜W(xué)制品(北京);四環(huán)素(實(shí)驗(yàn)室用)購自生工生物工程(上海);油紅購自美國Sina公司;四甲基偶氮唑鹽(TT)試劑盒購自美國Aers公司;甘油三酯(TG)測定試劑盒購自浙江東歐生物工程。2方法2.1肝細(xì)胞培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞株L-02，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所，用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。2.2雪靈芝提取物的制備將KAS全草粉碎，以6倍量的95%乙醇加熱回流提取3次，1h/次，合并提取液，濃縮枯燥得AKS乙醇提取

6、物。殘?jiān)鼡]干乙醇，用6倍量的蒸餾水加熱回流提取3次，1h/次，合并提取液，濃縮枯燥得AKS水提取物。2.3四環(huán)素濃度確實(shí)定將處于對數(shù)生長期的L-02細(xì)胞調(diào)整濃度為5104個(gè)/l培養(yǎng)于96孔板中，分別參加不同濃度的四環(huán)素(見表1)，用TT7比色法測定細(xì)胞增殖情況(以吸收度D值表示)。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)觀察，選擇對細(xì)胞活性影響小，不會導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡的濃度作為誘導(dǎo)細(xì)胞形成脂肪變性的最正確濃度。2.4雪靈芝提取物濃度確實(shí)定將處于對數(shù)生長期的L-02細(xì)胞調(diào)整濃度為5104個(gè)/l培養(yǎng)于96孔板中，分別參加不同濃度的雪靈芝提取物(見表2)，用TT比色法測定細(xì)胞增殖情況(以吸收度D值表示)。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)觀察，將對

7、細(xì)胞活性影響小，不會導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡的濃度定為最高給藥濃度。2.5肝細(xì)胞脂變模型的建立將處于對數(shù)生長期的L-02細(xì)胞分為兩組，即：對照組、誘導(dǎo)組，使每組細(xì)胞濃度均為5104個(gè)/l。對照組：用正常培養(yǎng)基培養(yǎng);誘導(dǎo)組：每毫升正常培養(yǎng)基中加四環(huán)素12g培養(yǎng)。在各實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)48h，搜集細(xì)胞凍融液，嚴(yán)格按照TG試劑盒規(guī)定操作，測定其中TG的含量。制備油紅染色8標(biāo)本，觀察細(xì)胞脂滴數(shù)的變化。2.6雪靈芝提取物對肝細(xì)胞脂變模型的影響將處于對數(shù)生長期的L-02細(xì)胞分為3組，使每組細(xì)胞濃度均為5104個(gè)/l。誘導(dǎo)組：損傷同時(shí)加藥治療48h;繼續(xù)誘導(dǎo)組：先損傷48h，再在損傷的同時(shí)加藥治療48h;脫離誘導(dǎo)組：先

8、損傷48h，再加藥治療48h。每組內(nèi)均設(shè)有空白對照、模型、陽性對照及高、中、低3個(gè)劑量組，在各實(shí)驗(yàn)條件下搜集細(xì)胞凍融液，嚴(yán)格按照TG試劑盒規(guī)定操作，測定其中TG的含量。用100gl-1煙酸作為陽性對照藥。2.7數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均以s表示，采用方差分析進(jìn)展統(tǒng)計(jì)處理。3結(jié)果3.1四環(huán)素作用濃度確實(shí)定觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，正常肝細(xì)胞為多邊形，胞膜完好界限清楚，細(xì)胞漿豐富。四環(huán)素15gl-1組細(xì)胞數(shù)量與正常細(xì)胞相比根本不變，低倍鏡下可見局部細(xì)胞形態(tài)有少許變化，但漂浮壞死細(xì)胞較少。30gl-1組細(xì)胞增大變圓，數(shù)量有減少。120gl-1組細(xì)胞多呈圓形或橢圓形，數(shù)量大大減少，細(xì)胞膜不完好，有破損(圖13)。TT

9、實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果提示：四環(huán)素濃度超過30gl-1時(shí)吸收度(D值)下降明顯，對細(xì)胞增殖影響力較大(表1)，再根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)9報(bào)道，選擇12gl-1作為四環(huán)素造模劑量。表1TT法檢測四環(huán)素對肝細(xì)胞生長活性的影響(3.2雪靈芝提取物的濃度確定TT檢測結(jié)果提示(表2)，當(dāng)AKS醇提物濃度超過80gl-1時(shí)，吸光度(D值)下降明顯，對細(xì)胞增殖影響較大，AKS水提物出現(xiàn)了濃度越高，細(xì)胞增殖才能及活性越強(qiáng)的特點(diǎn)。再結(jié)合預(yù)試結(jié)果，將雪靈芝提取物的實(shí)驗(yàn)濃度定為20，40，60gl-1。表2TT法檢測雪靈芝提取物對肝細(xì)胞生長活性的影響3.3油紅染色光學(xué)顯微鏡觀察正常L-02細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)僅可見點(diǎn)狀散在紅色脂肪滴(圖4)，

10、經(jīng)12gl-1四環(huán)素離體誘導(dǎo)48h后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量聚集成顆粒狀的紅色脂肪滴(圖5)。而正常L-02細(xì)胞經(jīng)60gl-1雪靈芝提取物與12gl-1四環(huán)素共同培養(yǎng)48h后，細(xì)胞內(nèi)脂滴與模型細(xì)胞相比有所減少見圖67。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.圖4正常細(xì)胞(100)圖5模型細(xì)胞(100)圖6AKS水提物(100)圖7AKS醇提物(100)3.4肝細(xì)胞內(nèi)TG含量的測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明(見表2)，各組加四環(huán)素的模型細(xì)胞比不加任何藥物的正常對照細(xì)胞胞漿內(nèi)的TG值明顯升高，參加煙酸的陽性對照細(xì)胞與模型細(xì)胞相比細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯降低。各組給予雪靈芝提取物處理后，細(xì)胞內(nèi)TG值均出現(xiàn)了明顯的降低。繼續(xù)誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)TG值與模

11、型細(xì)胞相比，差異明顯(P0.05)，脫離誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)TG值降低最為明顯，說明只要停頓向培養(yǎng)液中加造模藥，細(xì)胞內(nèi)累積的甘油三酯可以自行降低，這與治療脂肪肝首要在于去除病因的理論是一致的。AKS醇提物在3組實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出較好的降脂作用(高劑量與模型組比擬，P0.01)，且各劑量之間存在著一定的量效關(guān)系。AKS水提物在3組實(shí)驗(yàn)中，中劑量(40gl-1)的降脂作用強(qiáng)于高、低劑量組(P0.01)。表3AKS對脂變細(xì)胞TG含量的影響4討論本實(shí)驗(yàn)采用四環(huán)素制備肝細(xì)胞脂變模型，四環(huán)素屬于抗生素類化學(xué)藥物，該藥脂溶性較好，具有肝毒性，能很好地浸透到大多數(shù)組織和體液中，且較易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)10。四環(huán)素引起脂肪肝的機(jī)制

12、是抑制體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，特別是肝的載脂蛋白的合成，使肝內(nèi)VLDL分泌發(fā)生障礙，從而不能使肝內(nèi)TG運(yùn)出肝細(xì)胞外，脂質(zhì)以脂滴的形式聚于細(xì)胞內(nèi)置網(wǎng)和高爾基復(fù)合體內(nèi)。脂質(zhì)及TG含量增加，肝臟脂質(zhì)過氧化反響也增強(qiáng)，肝組織學(xué)檢查顯示，肝細(xì)胞產(chǎn)生明顯的小泡性脂肪變性，符合非酒精性脂肪肝病理學(xué)研究結(jié)果11。其抑制蛋白質(zhì)作用機(jī)制可能通過抑制肝細(xì)胞線粒體DNA復(fù)制或干擾DNA轉(zhuǎn)錄，使RNA合成減少，從而使RNA翻譯成載脂蛋白的量減少。通過抑制肝內(nèi)TG的轉(zhuǎn)運(yùn)及肝細(xì)胞線粒體對脂肪酸的-氧化，從而誘發(fā)肝細(xì)胞脂肪變性。本實(shí)驗(yàn)將雪靈芝提取物作用于離體細(xì)胞模型，共分為3組：誘導(dǎo)組，損傷同時(shí)加藥治療2d;繼續(xù)誘導(dǎo)組，先損傷2d

13、再在損傷同時(shí)加藥治療2d;脫離誘導(dǎo)組，先損傷2d再加藥治療2d。誘導(dǎo)組可以考察藥物對脂肪肝的預(yù)防與減輕作用，繼續(xù)誘導(dǎo)組和脫離誘導(dǎo)組可以考察有化學(xué)損傷因素存在或曾經(jīng)服用肝毒性藥物造成肝損害后，藥物對肝細(xì)胞的治療與保護(hù)作用。由脫離誘導(dǎo)組實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，一些高脂血癥的患者不用馬上服用降脂藥，首先應(yīng)該停頓使用或接觸具有肝毒性的化學(xué)物質(zhì)，通過中藥保健品或單純飲食療法即可獲得痊愈。目前對NAFLD的治療臨床上多采用西藥治療，主要分為：HG-A復(fù)原酶抑制劑、膽汁酸螯合劑、苯氧芳酸類、煙酸類等。西藥對于高脂血癥患者具有起效快、作用強(qiáng)的特點(diǎn)，但這些藥物對人體均有不同程度的毒副作用，長期服用經(jīng)常會出現(xiàn)不良反響，而采

14、用傳統(tǒng)中藥治療脂肪肝，能有效防止并發(fā)癥，減少由藥物引起的不良反響，研究和開發(fā)降脂中藥有良好的前景和重要的意義。雪靈芝中已經(jīng)說明構(gòu)造的19種化合物大局部是脂溶性較高的12。其中三萜皂苷、環(huán)肽、生物堿(-咔波啉)、阿魏酸被認(rèn)為是雪靈芝中重要的活性成分。近年來，三萜皂苷、環(huán)肽類化合物在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗菌等方面的作用，已引起了廣泛的關(guān)注13。本實(shí)驗(yàn)對雪靈芝醇提和水提物進(jìn)展了研究，認(rèn)為雪靈芝醇提物具有明顯的降低脂變肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的作用，進(jìn)一步研究雪靈芝中的有效成分，可以開發(fā)出新的有價(jià)值的降脂藥物。【參考文獻(xiàn)】1范建高.酒精性和非酒精性脂肪肝性肝病J.中華肝臟病雜志，2022，11(11)：

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