實(shí)驗(yàn)七sds-page測(cè)蛋白分子量

1、SDS測(cè)蛋白分子量實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誗DS檢測(cè)蛋白分子量原理和方法掌握垂直板電泳的操作方法實(shí)驗(yàn)步驟1、洗凈玻璃板，蒸餾水沖洗3遍，吹干并安裝電泳槽。2、制作12%分離膠。按下表中所列順序加試劑，輕輕搖勻，加入兩塊玻璃板間，高度約玻璃板高度的一半。3、用1mL蒸餾水封住分離膠液面，室溫聚合約20min，至分離膠與水之間出現(xiàn)一條清亮的分界線，倒掉水層，用濾紙條吸干殘余的水。4、倒出水并用濾紙吸干，配好5%濃縮膠，輕輕搖勻，加入濃縮膠，迅速插入樣梳，靜置約25分鐘。 水封的目的是為了使分離膠上沿平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。樣梳需一次平穩(wěn)插入。梳口處不得有氣泡，梳底需水平

2、。12%分離膠試劑名稱12%分離膠ddH2O2.5 mL30% Acr-Bis (29:1)3.0 mL1.5M Tris-HCl（pH8.8）2.0 mL10% SDS75 uLTEMED（加速劑）10 uL10% APS（催化劑，最后加）75 uL總體積7.5 mL分離膠的高度為整個(gè)凝膠高度的一半試劑名稱5%ddH2O3.4 mL30% Acr-Bis （29:1）0.86mL1M Tris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50 uLTEMED20 uL10%AP（最后加）50 uL總體積5 mL5%濃縮膠 6、將膠板放入電泳槽，加入1Tris-Gly電泳緩沖液，拔掉梳子，液面

3、應(yīng)該完全沒(méi)過(guò)電極。7、制樣：待測(cè)蛋白40 uL+藍(lán)色的樣品緩沖液15 uL，在沸水中加熱3分鐘，以除掉亞穩(wěn)態(tài)聚合7、點(diǎn)樣點(diǎn)樣孔分別點(diǎn)30ul、15ul和10ul樣品，每板膠點(diǎn)20ul Marker（老師準(zhǔn)備）。8、80V電泳20min，等蛋白進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)節(jié)到120V，繼續(xù)電泳。溴酚藍(lán)接近膠底部時(shí)，關(guān)閉電源。電泳結(jié)束。10、撬開(kāi)玻璃板，將凝膠做好標(biāo)記， 放在塑料盒內(nèi)，加入染色液，染色30min左右。(染色液需回收，可反復(fù)使用)11、染色后的凝膠用蒸餾水煮沸脫色。（高火微波爐中煮5分鐘）實(shí)驗(yàn)步驟蛋白質(zhì)與SDS按1：1.4比例形成復(fù)合物，消除了各種蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)的遷移

4、速度只取決于分子大小。在15-200KD之間，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系：logMW=K-bm實(shí)驗(yàn)原理不連續(xù)系統(tǒng): 緩沖液離子成分、pH、 凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性。 電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)。連續(xù)系統(tǒng)：電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同。 電荷、分子篩效應(yīng)。（三個(gè)不連續(xù)性）1、凝膠孔徑的不連續(xù)性（2種孔徑的凝膠）2、緩沖液離子成分及pH值的不連續(xù)性（2種緩沖體系，3種pH）：濃縮膠，pH6.8，蛋白質(zhì)分子的遷移率比Cl- 低，比Gly高。3、電位梯度不連續(xù)性：快離子（ Cl- ）后面形成高電位梯度區(qū)，慢離子（Gly）前面形成低電位梯度區(qū)，高電位梯度和低電位梯度之間的地

5、方，形成一個(gè)穩(wěn)定而不斷向陽(yáng)極移動(dòng)的界面，蛋白質(zhì)分子在界面處濃縮成一個(gè)狹小的中間層。濃縮效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：log MW = K - bm 蛋白質(zhì)區(qū)帶中心至分離膠上沿距離 相對(duì)遷移率= 溴酚藍(lán)至分離膠上沿距離 以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)作縱坐標(biāo)，相對(duì)遷移率作橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在計(jì)算出待測(cè)蛋白的遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量。實(shí)驗(yàn)試劑 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Mark） 兔磷酸化酶B MW=97400 牛血清白蛋白 MW=66200 兔肌動(dòng)蛋白 MW=43000 牛碳酸酐酶 MW=31000 胰蛋白酶抑制劑 MW=20100 雞蛋清溶菌酶 MW=1440030%丙烯酰胺（Acr）10%SDS1.0mol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液1.0