2021核酸檢測基本知識-1(Word最新版)

1、第第 頁共8頁第第5頁共8頁這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成1個循環(huán)需24min,23h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。檢測HIVRNA,需要先利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA,繼而以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可，這樣的反應(yīng)稱為RT-PCRoe.實時熒光定量PCR技術(shù)實時熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。、本技術(shù)的原理是使用熒光基團(tuán)標(biāo)記探針3端標(biāo)記熒光基團(tuán)R3端標(biāo)記淬滅基團(tuán)Q,在沒有PCR擴(kuò)增時，由于熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)空間距離很近，使熒光基團(tuán)被淬滅不發(fā)熒光;而當(dāng)PCR擴(kuò)增時

2、引物與熒光標(biāo)記的特異性探針同時結(jié)合在模板上熒光標(biāo)記的探針與模板的結(jié)合位置位于上下游弓1物之間利用Taq酶的53外切酶活性，將熒光探針?biāo)?熒光基團(tuán)被釋放出來，由于在空間上與淬滅基團(tuán)分開，則發(fā)出熒光。發(fā)出的熒光可以被熒光探頭檢測到一邊擴(kuò)增一邊檢測這樣就實現(xiàn)了“實時”檢測。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從半定量到定量的飛躍而且與常規(guī)PCR相比它具有特異性強(qiáng)、自動化程度高、有效解決了PCR污染問題等特點。f.支鏈DNA檢測法bDNAbDNA是定量檢測血漿中的HIV1型RNA的一種方法。bDNA是指人工合成的帶有側(cè)鏈的DNA片段在其每個側(cè)鏈上都可以標(biāo)記被激發(fā)的標(biāo)記物。將HIV的RNA通過離心從病毒顆粒中釋放出

3、來,然后用捕獲探針1將其捕獲到微孔中。捕獲探針2與病毒RNA的另一部分特異結(jié)合，又與預(yù)放大探針結(jié)合。后者再與放大探針即bDNA探針雜交。兩套靶探針分別與病毒RNA的pol基因的不同區(qū)域特異結(jié)合。在微孔中形成HIVRNA寡核苷酸復(fù)合物。再加入1種化學(xué)發(fā)光底物孵育后可放大化學(xué)發(fā)光信號。通過發(fā)光強(qiáng)度來定量,因為發(fā)光強(qiáng)度與樣品中HIVRNA含量成比例。bDNA不存在擴(kuò)增物的交叉污染這較PCR是一大進(jìn)步。bDNA有數(shù)十個覆蓋整個基因組的探針，可以方便地檢測HIV某些變異株,但靈敏度不及PCR,提高bDNA靈敏度是一大難點。檢測步驟./HIV核酸定性檢測技術(shù)，其檢測過程分為核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、P

4、CR擴(kuò)增反應(yīng)、擴(kuò)增產(chǎn)物定性分和結(jié)果判定和完成報告單。6.實驗室檢測具體步驟如下：a.核酸提取使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法以及自動化儀器等商品化試劑或設(shè)備并按說明書操作。提取RNA時應(yīng)注意防止RNA降解。DNA應(yīng)置于-20保存，RNA和需長期保存的DNA應(yīng)置于-80保存。b.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)需使用逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴(kuò)增儀或水浴箱中，在規(guī)定的溫度和時間下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。建議使用商品化RT-PCR一步法試劑進(jìn)行第一輪擴(kuò)增反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)需使用逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTP

5、s、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴(kuò)增儀或水浴箱中，在規(guī)定的溫度和時間下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用商品化RT-PCR一步法試劑進(jìn)行第一輪擴(kuò)增反應(yīng)。c.PCR擴(kuò)增反應(yīng)（使用二次擴(kuò)增的套式PCR擴(kuò)增方法）PCR反應(yīng)需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、緩沖液、和適量無RNA/DNA酶超純水、以及模板（DNA或cDNA）。在擴(kuò)增儀中，按照設(shè)定的程序進(jìn)行擴(kuò)增。使用二次擴(kuò)增的套式PCR擴(kuò)增方法。乂/e.擴(kuò)增產(chǎn)物定性分析擴(kuò)增產(chǎn)物常用分析方法是瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標(biāo)準(zhǔn)比較，判斷擴(kuò)增片段是否在預(yù)期的分子量范圍內(nèi)。其它擴(kuò)增產(chǎn)物分析方法還有限制性內(nèi)切酶酶切分析、特異性探針雜交分析以及DNA序列分析等。自動化核酸擴(kuò)增儀使用酶聯(lián)比色分析或熒光探針雜交等原理測定。、f.結(jié)果判定和完成報告單（1）實驗成立的條件：每一次檢測需同時做兩個陽性對照、兩個陰性對照，只有陽性對照擴(kuò)增出預(yù)期的片段、陰性對照沒有擴(kuò)增出任何片段、雙份平行樣品結(jié)果一致的情況下實驗才成立，可以作出核酸陽性或陰性反應(yīng)結(jié)果的判定。（2）HIV核酸檢測陽性：發(fā)現(xiàn)核酸陽性反應(yīng)，應(yīng)該重復(fù)采集樣品進(jìn)行復(fù)測，復(fù)測結(jié)果呈核酸陽