空氣輔助霧化的細(xì)胞遞送參數(shù)的優(yōu)化

1、空氣輔助霧化的細(xì)胞遞送參數(shù)的優(yōu)化大面積皮膚傷口與多種突發(fā)事件、重大疾病緊密相關(guān)，是臨床上常見病癥，其遷延不愈的特性嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命，并且在全球范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)1-2。由大面積皮膚創(chuàng)傷而引發(fā)的一系列嚴(yán)重并發(fā)癥和感染是威脅患者生命的兩個(gè)重要因素3。因此，除了給患者靜脈注射液體和營養(yǎng)素以抵消脫水和補(bǔ)充失去的蛋白質(zhì)外，采取有效的治療方法以減輕患者疼痛和挽回生命顯得至關(guān)重要。目前臨床實(shí)踐的有效治療方法主要為自體皮膚移植術(shù)4-5，但對(duì)于自體皮源本已稀缺的患者，該方法仍面臨著巨大挑戰(zhàn)。細(xì)胞移植術(shù)是解決這個(gè)問題的有效方法6-8，即從患者身上采集自體皮膚細(xì)胞（通常是角質(zhì)形成細(xì)胞）

2、后直接遞送到傷口，或經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)傳代后懸浮，再遞送到傷口。事實(shí)證明，細(xì)胞移植術(shù)可以顯著影響細(xì)胞在傷口中的分布和增殖9-11。近些年，細(xì)胞移植術(shù)已經(jīng)從靜脈注射、肌肉注射、注射器或移液槍的局部滴/注12-13發(fā)展到霧化式噴灑14-16。盡管靜脈注射、肌肉注射或局部細(xì)胞給藥均顯示出治療效果，但前兩種給藥方法會(huì)導(dǎo)致作用于傷口部位的細(xì)胞濃度低，治療效果不佳12；通過移液槍或注射器進(jìn)行局部細(xì)胞給藥雖可減少患者疼痛，但細(xì)胞遞送效率低，且分布不均勻13。細(xì)胞懸浮液噴霧自體移植用自體表皮衍生細(xì)胞，使用更小的自體部位（供體部位與燒傷面積比例可達(dá)1100）即可在短時(shí)間內(nèi)完成再上皮化16-17，對(duì)于深部、大面積和不規(guī)

3、則創(chuàng)面，該方法能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的快速和高效的遞送。目前涉及組織修復(fù)與再生應(yīng)用的空氣噴槍或霧化裝置仍存在一些缺陷，如生成的霧滴大小不一致、分布不均勻18，霧化參數(shù)對(duì)霧化特性的精確控制尚不清楚9，在輔助空氣壓力為69 kPa下，細(xì)胞活化率僅為65%19，有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道20對(duì)細(xì)胞霧化遞送4天后，細(xì)胞增殖能力大受影響，細(xì)胞活化率降為45%。如何實(shí)現(xiàn)藥物的均勻化霧化、不同面積的霧化或較高的細(xì)胞活化率霧化是細(xì)胞給藥霧化遞送裝置開發(fā)中需面臨的幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問題。空氣輔助霧化方法具有僅需較低空氣壓力和射流壓力即可實(shí)現(xiàn)較好的霧化效果，以及較大的射流通道可避免堵塞等特點(diǎn)21，本文構(gòu)建了基于該霧化方法的可用于細(xì)胞遞送的霧化

4、裝置，通過對(duì)其霧化特性測(cè)試方法研究，側(cè)重分析霧化高度、輔助氣體流量和射流流量等霧化參數(shù)對(duì)霧化特性和生物墨水（Bio-ink）遞送的影響，以指導(dǎo)霧化參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計(jì)和提高生物墨水的霧化噴涂效率。2 裝置設(shè)計(jì)及試劑材料2.1裝置原理及設(shè)計(jì)空氣輔助霧化的細(xì)胞遞送裝置（Air-Assisted Atomization Device，AAAD）的工作原理如圖1（a）所示，空氣泵輸出的氣體通過空氣濾芯過濾后分兩個(gè)流路，一路經(jīng)氣壓調(diào)節(jié)閥后在霧化噴嘴出口處形成穩(wěn)定的高速渦旋氣流，另一路也經(jīng)氣壓調(diào)節(jié)閥以穩(wěn)定壓力驅(qū)動(dòng)無菌儲(chǔ)液管中細(xì)胞懸浮液，并在噴嘴的針管出口形成液柱或液膜。在噴嘴出口處，氣體與生物墨水之間會(huì)形成很高

5、的相對(duì)速度，從而破壞液柱或液膜，改變生物墨水的流動(dòng)性、表觀粘性和表面張力，最終使連續(xù)相的生物墨水變成分散相以達(dá)到霧化效果。其中，兩個(gè)流路中氣壓調(diào)節(jié)閥分別用于調(diào)節(jié)輔助空氣氣壓以控制氣體流量和調(diào)節(jié)無菌儲(chǔ)液管的驅(qū)動(dòng)壓力以控制射流流量。為分析霧化高度對(duì)霧化性能的影響，霧化噴嘴可沿導(dǎo)桿做上下滑動(dòng)。圖1AAAD原理及裝置Fig.1Principle and setup for air-assisted atomization deviceAAAD主要包含氣動(dòng)控制模塊和霧化噴嘴模塊兩部分，實(shí)物分別如圖1（b）和圖1（c）所示。裝置主要組成部件包含流量為10 L/min的微型空氣壓縮泵（中國，SKOOCOM）

6、，100 kPa與200 kPa量程且靈敏度均優(yōu)于0.2%的精密調(diào)壓閥（日本，SMC），儲(chǔ)液筒（日本，MUSASHI），27G霧化針管（日本，MUSASHI），霧化針管的內(nèi)徑為200250 m，噴嘴的內(nèi)徑為0.71.0 mm。采用量程為5 L/min且精度優(yōu)于1.5%的微型空氣流量計(jì)（中國，SENLOD）和量程為40 mL/min且精度優(yōu)于5%的微型液體流量計(jì)（瑞士，SENSIRION）來測(cè)量輔助氣體流量和射流流量。2.2試劑材料人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT，中國，COBIOER）用含10%胎牛血清（FBS，中國，TIANHANG）和1%青霉素/鏈霉素（A5955，Sigma）的高糖培養(yǎng)基（D

7、MEM，Gibco）在T75 cm培養(yǎng)瓶（美國，CORNING）中培養(yǎng)，孵育條件為37 、CO2的體積分?jǐn)?shù)為5%。每4天傳代一次，每隔一天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%以上匯合時(shí)，用胰蛋白酶（15090046，Gibco）收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸液在室溫下以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去上清液，再將細(xì)胞重懸于無菌生理鹽水（ST341，中國，Beyotime）中，配制成細(xì)胞密度約為106 cells/mL的生物墨水。在霧化基本特性測(cè)試中，均以無菌生理鹽水為研究對(duì)象。3 霧化特性測(cè)試方法3.1霧滴粒徑分布及均勻度分析本文采用激光粒度儀（JL-3000，中國，JNGX）對(duì)霧滴粒徑進(jìn)行測(cè)

8、量。該儀器主要基于夫瑯和費(fèi)（Fraunhofer）衍射理論測(cè)量霧滴尺寸及對(duì)應(yīng)的霧滴個(gè)數(shù)。霧化噴嘴產(chǎn)生的霧滴是由大小不等的霧滴群組成，本文霧滴粒徑分布采用體積累積分布表示，平均粒徑采用體積平均粒徑D4，3計(jì)算，即：D4,3=nD4nD3（1）經(jīng)換算可得：D4,3=fD（2）其中：n是各個(gè)單一粒徑對(duì)應(yīng)的霧滴個(gè)數(shù)；D是霧滴的粒徑，單位為m；f是各單一粒徑的霧滴群對(duì)應(yīng)的體積頻度。通常，霧滴粒徑是不連續(xù)的，但當(dāng)霧滴數(shù)量足夠多時(shí)，可假設(shè)霧滴的粒徑累計(jì)分布是連續(xù)的，通常其符合Rosin-Rammler分布（簡(jiǎn)稱“R-R”分布）規(guī)律22，即：F(Di)=1exp(DiD)k（3）其中：F(Di)表示霧滴粒徑小

9、于Di的體積累計(jì)百分比；D為霧滴的特征尺寸，即F(Di)=0.632對(duì)應(yīng)的霧滴粒徑；k為均勻度指數(shù)，k越大，表示霧滴粒徑分布的均勻性越好。對(duì)于符合“R-R”分布規(guī)律的霧化，若粒徑Di和Dj對(duì)應(yīng)的累計(jì)百分比分別為F(Di)和F(Dj)，則由式（3）不難推導(dǎo)出霧化均勻度指數(shù)kDi,Dj，即：kDi,Dj=1lgDilgDj(lgln11F(Di)lgln11F(Dj).（4）3.2霧化角測(cè)試及霧化面積評(píng)估霧化過程中霧滴群在空間呈圓錐狀分布，該圓錐的張角即為霧化角，其大小直接影響霧化面積A。本文采用工業(yè)相機(jī)（DMK 23G445，德國，THE IMAGING SOURCE）對(duì)霧化狀態(tài)攝像后，在Mat

10、lab（美國，MathWorks）中計(jì)算霧化角。使用寬工作距離范圍的物鏡（BLADE 2.4/12， Korea， FIM optcis），攝像分辨率為640480像素，其中每個(gè)像素對(duì)應(yīng)物方尺寸為139 m。由于單幀圖像信噪比（Signal-to-Noise Ratio，SNR）較低，邊界提取不準(zhǔn)確，而隨著圖像疊加數(shù)量的增加，SNR也將增大。經(jīng)測(cè)試，單幀圖像的SNR僅為11.8 dB，用于霧化邊界提取誤差較大，通過對(duì)多幀圖像進(jìn)行疊加，可顯著提高圖像的SNR。當(dāng)疊加圖像達(dá)到227幀時(shí)，圖像SNR為50 dB，對(duì)疊加后的高SNR圖像進(jìn)行二值化處理，能夠有效保留霧化邊界，且邊界更加清晰。隨著圖像的疊

11、加數(shù)量增多，SNR將進(jìn)一步增大，如當(dāng)疊加視頻中所有圖像時(shí)（總幀數(shù)為238），圖像SNR可達(dá)65.5 dB。本文計(jì)算霧化角的方法是：先對(duì)霧化過程進(jìn)行連續(xù)視頻拍攝，分析時(shí)，疊加視頻的所有幀的圖像，以提高圖像SNR，如圖2（a）為單幀圖像，圖2（b）為視頻疊加圖像；對(duì)霧化角圖像進(jìn)行二值化，采用局部自適應(yīng)閾值分割算法，該算法可根據(jù)局部光強(qiáng)分布自動(dòng)調(diào)整二值化閾值，對(duì)于邊界的識(shí)別更加準(zhǔn)確和穩(wěn)定，如圖2（c）；圖2（d）為二值化圖像的邊界數(shù)據(jù)點(diǎn)，考慮到靠近噴嘴和遠(yuǎn)離噴嘴處的霧化角度有所變化，因此數(shù)據(jù)點(diǎn)的分析也分為兩部分，采用最小二乘法擬合數(shù)據(jù)點(diǎn)，得到邊界直線方程，進(jìn)而計(jì)算得到靠近噴嘴的霧化角1和遠(yuǎn)離噴嘴處的

12、霧化角2。如圖2（d）所示，計(jì)算出霧化角1和2后，可進(jìn)一步估算出生物墨水噴灑在基板上的面積A，即：圖2霧化角測(cè)試方法Fig.2Measurement method of atomization angleA=hN(tan12tan22)+hFtan222,(hNtan12)2,hNhFhNhF（5）其中：hN為最小二乘法擬合直線斷點(diǎn)位置距離噴嘴出口位置的高度，hF為霧化基板距離噴嘴出口位置的高度，單位均為mm。3.3霧滴沉降速度由于霧滴沉降速度會(huì)影響細(xì)胞活性23，本文利用高速相機(jī)（HS1，德國，PCO）的雙快門捕獲功能來測(cè)算霧滴沉降速度，相機(jī)單次曝光時(shí)間設(shè)置為10 s，拍攝時(shí)間間隔T為3.58

13、 s。采用10遠(yuǎn)距離物鏡（375-039，日本，三豐），視場(chǎng)為1.652.75 mm2。由于曝光時(shí)間極短，拍攝圖像SNR較低，如圖3（a），很難對(duì)視場(chǎng)中的霧滴進(jìn)行準(zhǔn)確定位。本文采用BM3D去噪算法，可有效提高圖像質(zhì)量，如圖3（b）；利用二值化算法對(duì)圖像中的霧滴進(jìn)行識(shí)別后，如圖3（c），根據(jù)霧滴光強(qiáng)分布計(jì)算得到霧滴質(zhì)心坐標(biāo)(xT1,zT1)和(xT2,zT2)，高速相機(jī)雙快門捕獲圖像處理前與處理后分別如圖3（d）和圖3（e）所示；再根據(jù)相鄰兩幀圖像中霧滴的坐標(biāo)，分別計(jì)算出霧滴的橫向運(yùn)動(dòng)速度=|xT2xT1|/T，縱向運(yùn)動(dòng)速度vz=|zT2zT1|/T，以及合速度vr=2+vz2。圖3霧滴沉降速度

14、測(cè)試方法Fig.3Measurement method of droplet settling velocity3.4細(xì)胞活化率測(cè)試將配制好的生物墨水一部分用于無噴涂的陰性對(duì)照，采用注射器（2 mL，中國，KINDLY）擠壓遞送；另一部分用AAAD噴灑。為了評(píng)估霧化后活細(xì)胞數(shù)與死細(xì)胞數(shù)比例，采用Calcein/PI細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（C2022M，中國，Beyotime）在37 避光孵育30 min，再用倒置熒光顯微鏡（IX73，日本，OLYMPUS）拍攝熒光圖片，并利用ImageJ（美國，National Institutes of Health）對(duì)熒光圖像進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)和Merge

15、處理。細(xì)胞活化率由活細(xì)胞總數(shù)占細(xì)胞總數(shù)（含活細(xì)胞與死細(xì)胞）的百分比來表示。采用CCK-8試劑盒（C0043，中國，Beyotime）檢測(cè)噴涂或未噴涂的細(xì)胞在24 h、48 h及72 h后的活性，來分析AAAD噴涂對(duì)細(xì)胞增殖性能的影響。公開的文獻(xiàn)15中已分析了輔助空氣壓力PA對(duì)的影響，即在hF為100mm，PA70kPa時(shí)，PA對(duì)無顯著差異。在本文中，重點(diǎn)分析hF和輔助空氣流量QA對(duì)的影響。3.5統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)表示為平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差（Standard Deviation，SD），并使用Origin（美國，OriginLab）做非配對(duì)t檢驗(yàn)（Unpaired t test）、單因素方差分析（One-W

16、ay ANOVA）或雙因素方差分析（Two-way ANOVA），以評(píng)估各實(shí)驗(yàn)組之間的差異性。4 結(jié)果與討論4.1射流流量和霧化高度對(duì)霧滴粒徑分布的影響圖4為霧滴粒徑分布及霧化參數(shù)對(duì)其影響。QA設(shè)定為3 L/min，在不同QL和不同hF的霧化條件下，經(jīng)激光粒度儀得到不同霧滴粒徑及對(duì)應(yīng)的體積頻度f，如圖4（a）所示，由式（2）可計(jì)算出D4，3，根據(jù)式（3）可以得到“R-R”分布曲線，在該曲線上分別選取25%和75%累計(jì)百分比對(duì)應(yīng)下的粒徑大小D25和D75，一般選取D25和D75之間的分布情況來說明顆粒的集中情況15，利用式（4）計(jì)算出kD25,D75來定性分析霧滴的均勻度程度。圖4霧滴粒徑分布及

17、霧化參數(shù)對(duì)其影響，其中，H1H4分別表示霧化高度為25、50、75及100 mmFig.4Droplet size distribution and the influence of spray parameters on it，H1-H4 represented the spray height of 25， 50， 75 and 100 mm， respectively通過雙因素方差分析，可得出hF、QL以及兩者間的交互作用均對(duì)D4，3有顯著影響。利用單因素方差分析來具體探究它們之間的關(guān)系，如圖4（b），不難得到：（1）在同等hF下，QL對(duì)D4，3有顯著影響，表現(xiàn)為QL越大，D4，3越大；

18、（2）QL=0.2mL/min時(shí)，hF對(duì)D4，3無顯著影響；（3）以高度為25 mm實(shí)驗(yàn)組為參考組，在相同QL條件下，50 mm實(shí)驗(yàn)組與參考組差異不大，但75 mm實(shí)驗(yàn)組和100 mm實(shí)驗(yàn)組與參考組相比均顯著增大，這說明在霧化過程中，當(dāng)hF大于一定值后，隨著其進(jìn)一步增大，霧滴與霧滴間存在融合現(xiàn)象，使得D4，3有顯著增大趨勢(shì)，但當(dāng)QL過低時(shí)，hF對(duì)D4，3無顯著影響。封裝細(xì)胞的霧滴與基板發(fā)生撞擊中可能造成細(xì)胞損失，一般而言，D4，3越小，細(xì)胞活化率越低23；但D4，3過大時(shí)，細(xì)胞位于霧滴邊緣概率會(huì)增加，霧滴與基板撞擊過程中，細(xì)胞受到的剪切應(yīng)力會(huì)增大，降低24。因此，hF與QL在細(xì)胞遞送中是重要霧

19、化參數(shù)。細(xì)胞傳送裝置在實(shí)際使用中QL一般低于5 mL/min14，16，25，否則會(huì)影響生物墨水的利用率。經(jīng)測(cè)量，當(dāng)QA=3L/min時(shí)，PA20kPa。利用單因素方差分析可以得到：在H2實(shí)驗(yàn)組和H4實(shí)驗(yàn)組中，QL對(duì)kD25,D75有顯著不同的影響，但影響程度不一致，如圖4（c）所示，說明這兩組實(shí)驗(yàn)的霧滴生成狀態(tài)不穩(wěn)定；但在H1H4四組實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)QL相同時(shí)，hF對(duì)kD25,D75影響不大。為進(jìn)一步分析噴嘴出口的輔助空氣流場(chǎng)對(duì)霧化的影響，研究了20100 kPa輔助氣體壓力下的霧滴分布狀態(tài)，如圖4（d）所示，可得到：在PA50kPa時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組的kD25,D75相差不顯著；而在PA60kPa時(shí)，

20、各實(shí)驗(yàn)組的kD25,D75顯著提高，尤其在80 kPa和90 kPa實(shí)驗(yàn)組中，相對(duì)于前一個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)組而言，kD25,D75提高地非常顯著。雖然PA的增大能提高kD25,D75，但同樣會(huì)影響細(xì)胞遞送中值，在文獻(xiàn)15中已做了相關(guān)分析。因此，在一些生物材料需均勻化噴涂而不考慮指標(biāo)時(shí)，可以重點(diǎn)關(guān)注PA這項(xiàng)霧化參數(shù)。4.2霧化角及霧化面積的影響因素圖5為霧化參數(shù)對(duì)霧化角及霧化面積的影響。經(jīng)最小二乘法擬合邊界直線方程，在不同QL下可計(jì)算得到1和2，且hN25mm。從圖5（a）中可看到：在QA為3L/min的實(shí)驗(yàn)組中，隨著QL增大，1先從26.44增加到30.81之后一直遞減到8.04，而2在15.5525

21、.26間上下波動(dòng)；當(dāng)QL7mL/min時(shí)，12；而在QL為8 mL/min或9 mL/min時(shí)，12。結(jié)果表明，在QA恒定條件下，QL對(duì)1的影響比對(duì)2的影響顯著。利用式（5）可計(jì)算出在不同QL下的霧化面積A，其中取hN=25mm。不難發(fā)現(xiàn)在固定hF下調(diào)節(jié)QL時(shí)，在QL=3mL/min條件下的A最大，且hF越大，差異越顯著；在hF=25mm時(shí)，霧化面積可控制在100 mm2內(nèi)，可滿足小面積噴灑的工況，如圖5（b）所示。圖5霧化參數(shù)對(duì)霧化角及霧化面積的影響Fig.5Effect of atomization parameters on spray cone angle and spray area

22、如圖5（c），在QL為為3mL/min的實(shí)驗(yàn)組中，當(dāng)QA1.5L/min時(shí)，霧化不充分，且1略小于2；而當(dāng)QA2L/min時(shí)，霧化效果良好，1和2會(huì)顯著增大，且趨于平穩(wěn)，12。結(jié)果表明，在QL恒定條件下，為形成良好的霧化效果，QA需足夠大，建議不低于2 L/min。其中，部分霧化圖像如圖5（d）所示。4.3氣體流量和霧化高度對(duì)霧滴沉降速度的影響圖6（a）是霧滴沉降速度測(cè)試平臺(tái)；在QL為3mL/min，QA5L/min時(shí)，如圖6（b）所示，H1實(shí)驗(yàn)組的最高，隨著霧化高度hF變大，會(huì)降低，但H3與H4實(shí)驗(yàn)組的變化不大；在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，QA對(duì)影響不大；由圖6（c）和圖6（d）可知，vz和vr均比大的

23、多；在4個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，H2實(shí)驗(yàn)組的vz和vr最大；在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，QA對(duì)vz和vr影響也不顯著。圖6霧滴沉降速度測(cè)試及影響分析Fig.6Measurement and influence analysis of drop velocities結(jié)果表明，在輔助空氣低流量下，霧滴的運(yùn)動(dòng)速度受hF的影響較大；輔助氣體流場(chǎng)主要在噴嘴出口的小范圍內(nèi)影響，隨著hF變大，霧滴在空氣阻力作用下，會(huì)逐漸減??；霧滴的vz和vr在輔助氣體的作用下，有一段加速積累的過程，需運(yùn)行一定距離后才會(huì)逐漸降低。霧滴的運(yùn)動(dòng)速度直接影響其與霧化基板之間的剪切應(yīng)力，為保證細(xì)胞霧化遞送中的細(xì)胞活化率，霧滴的運(yùn)動(dòng)速度應(yīng)盡可能低。因此，對(duì)于本文設(shè)計(jì)的霧化噴嘴，應(yīng)避免在50 mm的霧化高度噴涂。4.4生物墨水霧化的細(xì)胞活化率影響因素經(jīng)倒置熒光顯微鏡拍攝和Image J軟件分析后，可得出陰性對(duì)照組和不同hF下實(shí)驗(yàn)組中，如圖7（a）。經(jīng)單因素方差分析，得到hF對(duì)有顯著的影響（p0.001）；將各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組作非配對(duì)t檢驗(yàn)，可得到在50 mm的霧化高度進(jìn)行細(xì)胞傳遞時(shí)，確實(shí)會(huì)顯著降低（p0.001），如圖7（b）所示，該結(jié)果同時(shí)證明了與霧滴粒徑分布和霧滴沉降速度均存在一定關(guān)聯(lián)。圖7（c）結(jié)