探究KCl代替NaCl對(duì)嗜酸乳桿菌和大腸桿菌的影響

1、探究KCl代替NaCl對(duì)嗜酸乳桿菌和大腸桿菌的影響NaCl是最重要的食品添加劑之一，不僅能增強(qiáng)食物的質(zhì)地和風(fēng)味，還具有防腐作用。過(guò)量攝入NaCl可能導(dǎo)致高血壓，是心血管疾病、中風(fēng)和腎臟疾病的危險(xiǎn)因素；同時(shí)增加肥胖及胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)1。因此，有必要使用代鹽以減少鈉鹽的攝入。由于KCl與NaCl的理化性質(zhì)相似,在既往研究中常作為NaCl的理想替代品。GAN等2報(bào)道在臘肉加工過(guò)程中KCl部分替代NaCl可促進(jìn)乳酸桿菌的生長(zhǎng)，有利于生產(chǎn)過(guò)程中的蛋白質(zhì)水解和脂質(zhì)氧化；KAMLEH等3證實(shí)KCl部分替代NaCl(30%)對(duì)Akkawi奶酪處理后，微生物隨儲(chǔ)藏時(shí)間增加而增長(zhǎng)，但與NaCl處理并無(wú)顯著性差異。嗜

2、酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)是一種常見(jiàn)的益生菌，在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用，是生產(chǎn)面包、酸奶、奶酪等發(fā)酵食品的主要菌種4。L.acidophilus能提高食品的保鮮質(zhì)量、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，與食品質(zhì)量密切相關(guān)5。大腸桿菌(Escherichiacoli)是腸道中最主要的細(xì)菌，是一種條件致病菌。某些血清型如E.coliO157:H7是高致病性的，可污染飲用水、奶制品、生鮮等，導(dǎo)致人群水樣腹瀉和嘔吐6。在食品工業(yè)中，必須嚴(yán)格控制E.coli數(shù)量低于國(guó)際安全標(biāo)準(zhǔn)，以確保食品質(zhì)量和安全。因此，探究一種在不顯著影響L.acidophilus的情況下能有效抑制E.coli生長(zhǎng)的代鹽至

3、關(guān)重要。增加鹽濃度使?jié)B透壓達(dá)到臨界值，革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞質(zhì)膜分離受到影響7。另一研究顯示當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)從5%增至10%時(shí)，革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)受到影響8。質(zhì)膜分離的突然發(fā)生會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和脫氧核糖核酸復(fù)制受到抑制，并引發(fā)細(xì)胞三磷酸腺苷水平的增加，從而導(dǎo)致大分子生物合成受到抑制9。因此，檢測(cè)并找到合適的總鹽濃度非常重要。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)從3%增至7%時(shí)，微生物磷酸己糖異構(gòu)酶、異檸檬酸脫氫酶和醛縮酶受到抑制8。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0增至5%時(shí)，細(xì)胞活力和酯酶活性降低10。因此本研究選擇總鹽濃度為6%的條件下對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的影響。研究表明，乳制品中不同的鹽濃度會(huì)影響細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)

4、進(jìn)而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和降低活性11-13。因此，本文將研究NaCl與KCl在總鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(6%)下的替代效果，并尋找一個(gè)不影響益生菌生長(zhǎng)又能抑制致病菌生長(zhǎng)的濃度組合，為KCl替代NaCl的適宜濃度提供依據(jù)。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與鹽干預(yù)無(wú)菌MRS和LB培養(yǎng)基中分別接種L.acidophilus和E.coli，獲得約108CFU/mL的初始濃度。稀釋L.acidophilus和E.coli懸液至OD值為0.60.7。再將細(xì)胞置于室溫(1820 )的不同鹽溶液中：A(0% NaCl和0% KCl)、B(6% NaCl和0% KCl)、C(3% NaCl和3% KCl)、D(0% NaC

5、l和6% KCl)。為了觀察上述NaCl和KCl干預(yù)后細(xì)胞的變化，在1 h、3、5和7 d等時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。為了長(zhǎng)期維持細(xì)胞生長(zhǎng)，在細(xì)胞懸浮液中加入乳糖(最終體積的2%)以提供足夠的營(yíng)養(yǎng)。1.2.2 細(xì)菌活菌數(shù)檢測(cè)用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算不同鹽干預(yù)對(duì)活菌數(shù)的影響。細(xì)胞懸液在不同鹽干預(yù)1 h、3、5和7 d后，用0.15%無(wú)菌蛋白胨水連續(xù)稀釋細(xì)胞(10-110-7)，將0.1 mLL.acidophilus和E.coli細(xì)胞懸液分別涂在MRS和LB瓊脂平板上。培養(yǎng)皿37 孵育48 h，計(jì)數(shù)CFU，3次重復(fù)。1.2.3 細(xì)胞膜完整性和酯酶活性檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)將鹽干預(yù)細(xì)

6、胞(950 L)與50 L羧熒光素二乙酸酯(carboxyfluorescein diacetate，cFDA)在37 水浴中孵育10 min，使cFDA在細(xì)胞內(nèi)酶促轉(zhuǎn)化為羧熒光素(carboxyfluorescein，cF)。去除多余cFDA，并向細(xì)胞中添加30 L 碘化丙二鈉(propylene sodium iodide，PI)。細(xì)胞在冰浴中孵育10 min，以標(biāo)記細(xì)胞膜受損。通過(guò)熱殺死細(xì)胞(100 水浴1 h)和活細(xì)胞調(diào)整正確的參數(shù)，并進(jìn)行染色14-15，cF染色細(xì)胞在488 nm激光激發(fā)后在530 nm處發(fā)出綠色熒光，PI染色細(xì)胞在635 nm處發(fā)出紅色熒光16，數(shù)據(jù)采用FlowJo

7、 7.6.2版(TreeStar Inc，美國(guó)阿什蘭州)分析，根據(jù)它們的熒光性能將4個(gè)細(xì)菌群分為4個(gè)象限。用公式(1)計(jì)算了不同鹽干預(yù)對(duì)細(xì)胞酯酶活性的影響。在Q3象限(四方圖右下)，僅用cF染色的細(xì)胞被認(rèn)為是監(jiān)測(cè)鹽干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)殘留的酯酶活性。Q3是鹽干預(yù)后細(xì)胞Q3象限的百分比，Q3控制是鹽干預(yù)前細(xì)胞Q3象限的百分比。細(xì)胞酯酶活性(1)1.2.4 細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變檢測(cè)傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)T-IR)稀釋L.acidophilus和E.coli懸液至OD值分別為1.7和1.5左右。離心(4 000g，4 ，10 min)收集鹽干預(yù)

8、細(xì)胞并在無(wú)菌生理鹽水中通過(guò)再懸浮洗滌2次，離心(4 000g，4 ，10 min)回收。將洗滌后的細(xì)胞懸浮在無(wú)菌蒸餾水中(100 mg濕細(xì)胞/mL)，取50 L細(xì)胞懸液置于CaF2光學(xué)板上，在50 的烘箱中干燥30 min。采用傅立葉變換紅外光譜儀進(jìn)行掃描，平均掃描20次，掃描范圍為4 0001 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。對(duì)光譜進(jìn)行變換(使用SavitzkyGolay算法進(jìn)行基線校正、平滑和歸一化)，并在閾值0.50%以上檢測(cè)到峰值。為了校正背景，在每個(gè)樣本之前記錄空氣光譜17。1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件采用單因素方差分析進(jìn)行多

9、組間比較；雙側(cè)P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Tukey事后檢驗(yàn)比較不同鹽濃度下均值之間的差異。2 結(jié)果與分析2.1 菌數(shù)測(cè)定分析活菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示(圖1)，在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，L.acidophilus經(jīng)A鹽干預(yù)的活菌量均大于B、C、D鹽干預(yù)，且B的數(shù)量最少，提示B鹽干預(yù)的抑制作用最大，C鹽干預(yù)值d鹽干預(yù)值，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。E.coli經(jīng)1 h鹽處理后B、C和D鹽干預(yù)的活菌數(shù)與A鹽干預(yù)相比，差異顯著(P0.05)，經(jīng)鹽處理3 d后C和D鹽干預(yù)的活菌數(shù)與A鹽干預(yù)相比，差異顯著(P0.05)。但5、7 d鹽處理后，與A鹽干預(yù)相比，差異不顯著(P0.05)。結(jié)果表明B、C和D鹽干預(yù)對(duì)

10、E.coli活菌數(shù)有明顯的抑制作用，且以C鹽干預(yù)效果最為顯著，但隨時(shí)間延長(zhǎng)差異變小。2.2 細(xì)胞膜完整性和酯酶活性測(cè)定分析菌落形成數(shù)不能反映鹽處理引起的細(xì)胞損傷程度和代謝活動(dòng)的詳細(xì)情況，因此，本研究應(yīng)用FCM進(jìn)一步檢測(cè)，根據(jù)其結(jié)構(gòu)或生理參數(shù)找到不同的亞群，以更好地了解細(xì)胞狀態(tài)。L.acidophilus鹽干預(yù)1 h結(jié)果如圖2-a所示：B鹽干預(yù)1 h的Q1象限的細(xì)胞數(shù)量(2.58%)在4個(gè)鹽干預(yù)中最多，表明B鹽干預(yù)的細(xì)胞死亡率最大，對(duì)L.acidophilus的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。鹽干預(yù)1 h，從B鹽到D鹽，大部分細(xì)胞位于Q3象限且Q3象限的細(xì)胞數(shù)量增加，分別為73.0%、73.2%、79.4

11、%，表明隨KCl濃度增加對(duì)L.acidophilus的抑制作用減弱；在3、5和7 d的試驗(yàn)中，B、C和D鹽干預(yù)的Q3象限的結(jié)果類似。LA-L.acidophilus；A-0% NaCl，0% KCl；B-6% NaCl，0% KCl；C-3% NaCl，3% KCl；D-0% NaCl，6% KCl(下同) a-1 h；b-3 d；c-5 d；d-7 d圖1 不同濃度的鹽干預(yù)不同時(shí)長(zhǎng)對(duì)L.acidophilus和E.coli活菌數(shù)的影響Fig.1 The impact of salt treatment after different treatment time on cell viabil

12、ity ofL.acidophilusandE.coli注：*表示在P0.05水平差異顯著；n=3(下同)a-L.acidophilus1 h鹽干預(yù)；b-E.coli1 h鹽干預(yù)圖2 cF與PI染色經(jīng)鹽干預(yù)1 h后對(duì)L.acidophilus和E.coli酯酶活性和膜完整性的流式點(diǎn)圖分析Fig.2 FCM dot plot of cF vs PI salt treatment after 1 h on esterase activity and membrane integrity ofL.acidophilusandE.coli.E.coli鹽干預(yù)1 h結(jié)果如圖2-b所示，B鹽干預(yù)1 h的Q

13、1象限的細(xì)胞數(shù)量(15.2%)在4種不同鹽干預(yù)中最多，表明B鹽干預(yù)的細(xì)胞死亡率最大，對(duì)E.coli的生長(zhǎng)有顯著抑制作用。鹽干預(yù)1 h，從B鹽到D鹽，Q3象限的細(xì)胞數(shù)量減少，分別為17.1%、16.5%和16.0%，表明隨KCl濃度增加對(duì)E.coli的抑制作用增強(qiáng)。在3 d的試驗(yàn)中觀察到相同的結(jié)果，而在5和7 d的試驗(yàn)中，B、C和D鹽處理的Q1象限的結(jié)果相似。此外，發(fā)現(xiàn)鹽干預(yù)1 h，大部分細(xì)胞位于Q2象限，而其他3個(gè)時(shí)間點(diǎn)大部分細(xì)胞位于Q4象限，即未染色細(xì)胞。根據(jù)FCM點(diǎn)圖計(jì)算和分析酯酶活性的數(shù)據(jù)如圖3所示，L.acidophilus酯酶活性在不同鹽濃度下隨時(shí)間逐漸降低。在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，B鹽干預(yù)對(duì)

14、酯酶活性的影響最為明顯，C鹽干預(yù)效果次之，D鹽干預(yù)效果最小。鹽干預(yù)1 h，B(90.58%)、C(92.41%)鹽干預(yù)組的酯酶活性均與A組有顯著性差異(P0.05)，但D(96.78%)鹽干預(yù)組的酯酶活性與A組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。鹽干預(yù)3、5和7 d，B、C、D鹽干預(yù)組的酯酶活性均與A組有顯著性差異(P0.05)。E.coli酯酶活性也在不同鹽濃度下隨時(shí)間逐漸降低。如圖3所示，不同鹽濃度干預(yù)1 h后，酯酶活性明顯下降至60%以下，但在3、5和7 d的實(shí)驗(yàn)中，酯酶活性急劇上升至80%以上，可能與E.coli逐漸對(duì)各種鹽干預(yù)適應(yīng)，細(xì)胞膜不同程度地得到修復(fù)相關(guān)，其酯酶活性也不同程度的提高

15、。結(jié)果表明，鹽干預(yù)1 h，不同濃度的鹽均能顯著降低酯酶活性，與A鹽干預(yù)有顯著性差異(P0.05)，其余3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，僅D鹽干預(yù)組對(duì)酯酶活性的抑制作用最大，與A鹽干預(yù)有顯著性差異(P0.05)。a-1 h；b-3 d；c-5 d；d-7 d圖3 鹽干預(yù)1 h、3 d、5 d和7 d對(duì)L.acidophilus和E.coli酯酶活性的影響Fig.3 The impact of salt treatment after 1-hour, 3-days, 5-days and 1-week on esterase activity ofL.acidophilusandE.coli2.3 FT-IR分析FT

16、-IR被證明在研究細(xì)菌應(yīng)激反應(yīng)和微生物代謝方面有重要意義，細(xì)菌的主要細(xì)胞構(gòu)件(蛋白質(zhì)、脂類、多糖及其衍生物及其組合)的特征被記錄。L.acidophilus和E.coli的FT-IR結(jié)果觀察到不同峰的波長(zhǎng)(閾值為0.5%)，如表1和表2所示。表1顯示L.acidophilus觀察到不同波峰：不同濃度鹽干預(yù)1 h，L.acidophilus的所有峰均能被檢測(cè)到。其他3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，僅在B鹽干預(yù)組的第3天檢測(cè)到1 377 cm-1的波峰，這與細(xì)胞壁蛋白中CH2的CH彎曲模式有關(guān)，而其他L.acidophilus樣品中則完全缺失，表明細(xì)胞壁蛋白中CH2的結(jié)構(gòu)受損。1 551 cm-1處的峰值代表酰胺

17、II區(qū)蛋白質(zhì)中較大的CH2變形，鹽干預(yù)第5天、第7天該峰值缺失，表明長(zhǎng)時(shí)間的鹽干預(yù)影響L.acidophilus細(xì)胞壁蛋白和肽，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損。3 302 cm-1處的峰值代表酰胺-A的NH拉伸模式。這個(gè)峰值在第5天及第7天未檢測(cè)到，表明細(xì)胞壁蛋白酰胺-A受損，提示隨著鹽干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損加重。2 9582 854 cm-1峰值區(qū)域代表脂肪酸區(qū)域，鹽干預(yù)實(shí)驗(yàn)的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)都能檢測(cè)到該區(qū)域的所有峰值，波數(shù)沒(méi)有明顯的變化。脂肪酸區(qū)域與膜流動(dòng)性有關(guān)，表明不同的鹽溶液對(duì)L.acidophilus細(xì)胞膜流動(dòng)性沒(méi)有影響。此外，代表酰胺I和酰胺II區(qū)，在1 539、1 647 cm-1的波峰在L.a

18、cidophilus所有標(biāo)本中有位移；代表酰胺-A區(qū)波長(zhǎng)為3 292 cm-1，在所有L.acidophilus樣品中也有位移。綜上，表明L.acidophilus細(xì)胞壁蛋白和肽對(duì)鹽溶液敏感，但細(xì)胞膜流動(dòng)性對(duì)鹽濃度的變化具有穩(wěn)定性。表2顯示E.coli觀察到不同波峰：實(shí)驗(yàn)干預(yù)的第3天，C和D鹽干預(yù)的E.coli均未出現(xiàn)1 551 cm-1的峰值，而在第5天和第7天，B、C和D鹽干預(yù)的E.coli該峰值完全缺失，表明E.coli的細(xì)胞壁蛋白和肽結(jié)構(gòu)受損。3 089 cm-1的吸收帶主要是不飽和碳的CH伸縮振動(dòng)，其波峰值在1 h的C鹽及3 d的A鹽和C鹽干預(yù)的E.coli中未檢測(cè)到，在5及7 d鹽

19、干預(yù)中均未檢測(cè)到。不同鹽干預(yù)的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能觀察到代表酰胺A的NH拉伸模式(3 290 cm-1)和脂肪酸區(qū)域(2 854、2 873、2 925、2 959 cm-1)的峰值，波數(shù)無(wú)明顯變化。1 235 cm-1處的峰值代表酰胺III區(qū)的-片層，C鹽干預(yù)1 h觀察到波峰值移至1 231 cm-1，且在第5天和第7天C鹽和D鹽干預(yù)中分別檢測(cè)到波峰值向1 234、1 233 cm-1移動(dòng)，表明E.coli從-片層到不規(guī)則結(jié)構(gòu)的變化，表明E.coli細(xì)胞壁蛋白質(zhì)和肽可能受到影響。3 討論活菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示B鹽干預(yù)對(duì)L.acidophilus抑制作用最顯著，C鹽干預(yù)對(duì)E.coli抑制作用最顯著。圖1可

20、觀察到E.coli在鹽干預(yù)的第3天、第5天和第7天的活菌量急劇增加，并且都大于1 h。推測(cè)鹽干預(yù)早期E.coli處于應(yīng)激狀態(tài)，活菌量減少，隨著鹽干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，E.coli適應(yīng)性提高并以完整或最小受損的代謝能力迅速生長(zhǎng)18-19。綜合L.acidophilus和E.coli的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，C鹽干預(yù)(3% NaCl，3% KCl)對(duì)E.coli生長(zhǎng)抑制作用最顯著，對(duì)L.acidophilus生長(zhǎng)的抑制作用弱，是理想鹽組合。FCM結(jié)果如圖2、3所示，可觀察到D鹽干預(yù)對(duì)L.acidophilus細(xì)胞膜完整性和酶活力的損傷最?。欢鴮?duì)E.coli損傷最大，表明D鹽干預(yù)(6% KCl，0% NaCl)是L.

21、acidophilus和E.coli理想鹽組合。FT-IR常用于研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，記錄分子的官能團(tuán)波數(shù)。4 0003 100 cm-1的區(qū)域代表了廣泛的構(gòu)象特征，3 300 cm-1的條帶歸于酰胺A族的NH拉伸模式17,20。3 1002 800 cm-1的波數(shù)代表烷基烴和脂肪酸區(qū)域，其主要有CH3、CH2和CH，通常存在于各種膜親脂成分上的官能團(tuán)的拉伸振動(dòng)21。1 8001 500 cm-1的區(qū)域是酰胺區(qū)，主要由細(xì)胞壁蛋白質(zhì)和肽的酰胺(1 7001 600 cm-1)和酰胺(1 5501 453 cm-1)條帶控制22-23。1 5001 200 cm-1的區(qū)域代表混合區(qū)域，即包含蛋白質(zhì)、脂肪酸和磷酸鹽攜帶化合物信息的光譜區(qū)域23。1 3301 295 cm-1代表蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)-螺旋；1 2951 270 cm-1代表-轉(zhuǎn)角；1 2701 250 cm-1代表無(wú)規(guī)卷曲；1 2451 220 cm-1代表-片層；1 2451 250 cm-1的邊界區(qū)域可能同時(shí)具有無(wú)規(guī)卷曲和-片層結(jié)構(gòu)；1 3001 295 cm-1的邊界區(qū)域可能同時(shí)來(lái)自-螺旋和-轉(zhuǎn)角結(jié)