工業(yè)蘿卜泡菜發(fā)酵過程中理化特性及真菌群落多樣性分析

1、PAGE 12 -工業(yè)蘿卜泡菜發(fā)酵過程中理化特性及真菌群落多樣性分析四川泡菜歷史悠久，因其富含維生素、礦物質(zhì)、有機(jī)酸和益生菌而成為家喻戶曉的開胃菜和佐菜，并已從傳統(tǒng)小型家庭作坊式生產(chǎn)發(fā)展為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)1。工業(yè)泡菜大多是使用食鹽直接腌制新鮮蔬菜而成，而蘿卜泡菜是其中的典型代表。蘿卜是四川盆地種植的主要農(nóng)作物之一，且蘿卜泡菜由于其質(zhì)地口感好、藥用價(jià)值高和營養(yǎng)價(jià)值豐富而成為重要的發(fā)酵蔬菜之一2。近年來，隨著分子微生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，高通量測序技術(shù)已經(jīng)廣泛運(yùn)用于發(fā)酵豆制品3-5、腐乳6、醬醋7、酸魚8、發(fā)酵茶9和發(fā)酵蔬菜10等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物群落結(jié)構(gòu)分析。LIANG等11研究表明四川工業(yè)榨菜

2、泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌是主要的活性微生物，乳酸桿菌(Lactobacillus)是發(fā)酵中后期的優(yōu)勢細(xì)菌屬。LIU等12闡明了中國南方傳統(tǒng)泡菜和北方辣白菜在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)上的差異，且總酸、乳酸和乙酸與辣白菜細(xì)菌群落呈正相關(guān)，與傳統(tǒng)泡菜細(xì)菌群落呈負(fù)相關(guān)。RAO等13研究發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)腌制蘿卜中乳酸桿菌是優(yōu)勢細(xì)菌屬，畢赤酵母(Pichia)和假絲酵母(Candida)是優(yōu)勢真菌屬。呂嘉櫪等14通過高通量測序發(fā)現(xiàn)不同原料的傳統(tǒng)老壇自然發(fā)酵泡菜的真菌群落結(jié)構(gòu)不同。因此現(xiàn)有研究大多關(guān)注于家庭泡菜中的細(xì)菌多樣性，對工業(yè)泡菜和真菌多樣性研究較少。迄今為止，尚未見到針對不同工藝四川工業(yè)泡菜發(fā)酵過程中的真菌多樣性研究報(bào)道。

3、本實(shí)驗(yàn)采用高通量測序技術(shù)對不同工廠蘿卜泡菜發(fā)酵過程中真菌多樣性進(jìn)行分析，同時(shí)結(jié)合理化指標(biāo)的變化，揭示工業(yè)蘿卜泡菜發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律，以期對工業(yè)蘿卜泡菜發(fā)酵工藝的全面優(yōu)化和發(fā)酵過程的精準(zhǔn)調(diào)控提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1材料與試劑NaOH、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰醋酸、四硼酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；草酸、酒石酸、乳酸、乙酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸(色譜純)，天津科密歐化學(xué)試劑公司；DNeasyPowerSoilKit試劑盒，德國QIAGEN公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒，美國AxygenBiosciences公司。1.2儀

4、器與設(shè)備PHS-3C酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；WS202鹽度計(jì)，上海民儀電子有限公司；LC-2030高效液相色譜儀，日本島津公司；MyCyclerTMThermalCyclerPCR儀，美國Bio-Rad公司；DYY-5瓊脂糖凝膠電泳儀，中國北京市六一儀器廠；LegendMicro17R高速冷凍離心機(jī)，美國賽默飛公司；IlluminaHiSeq2500測序平臺(tái)，美國Illumina公司。1.3實(shí)驗(yàn)與方法1.3.1樣品采集采集四川眉山兩個(gè)工廠(J廠和W廠)的發(fā)酵蘿卜漬液進(jìn)行分析，以新鮮蘿卜下池經(jīng)石壓7d左右出水時(shí)為取樣第0天，后續(xù)第30、60、120、180、240天分別取樣。取樣后

5、用冰袋迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室置于-80冰箱備用。1.3.2理化指標(biāo)的檢測采用pH計(jì)和鹽度計(jì)分別測定pH值和鹽度值；參照GB/T124562022食品總酸的測定測定樣品中總酸含量；采用鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽含量。采用高效液相色譜法測定有機(jī)酸含量。樣品處理：在4條件下以10000r/min離心15min，上清液用0.22m水系膜過濾。測定條件：色譜柱為AgilentZORBAX-SBC18(4.6mm250mm，5m)，流動(dòng)相為V(0.1%的磷酸緩沖液)V(甲醇)=955，流速0.8mL/min，柱溫40，進(jìn)樣量10L。紫外檢測器波長210nm，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和峰面積的比較，對其進(jìn)行定性和定量

6、。1.3.3DNA提取與測序采用DNeasyPowerSoilKit試劑盒提取發(fā)酵蘿卜漬液中微生物總DNA。使用ITS真菌通用引物：ITS1F(5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3)，ITS2R(5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3)對總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：5LQ5反應(yīng)緩沖液(5)，5LQ5保真GC緩沖液(5)，0.25L高保真DNA聚合酶(5U/L)，2L(2.5mmol/L)三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTPs)，前后引物各1L(10mol/L)，2LDNA模板，8.75LddH2O。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8預(yù)變性2min，98變性15s，55退火30s，72

7、延伸30s，循環(huán)35次，最后72延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，用ABIStepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行定量檢測，送至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序平臺(tái)為IlluminaHiSeq2500。1.3.4測序數(shù)據(jù)分析用QIIME計(jì)算Alpha多樣性，包括Chao1、Simpson、Shannon和Goodscoverage，以表征真菌群落結(jié)構(gòu)的豐富度和多樣性。使用非加權(quán)組平均法(unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmean,UPGMA)構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)。結(jié)

8、合UNITE數(shù)據(jù)庫(Release8.0,http:/unite.ut.ee/)進(jìn)行物種解釋。2結(jié)果與分析2.1工業(yè)蘿卜泡菜發(fā)酵過程的理化指標(biāo)分析總酸(totalacid，TTA)和pH是衡量泡菜發(fā)酵程度的重要指標(biāo)。如圖1所示，在發(fā)酵剛啟動(dòng)時(shí)，兩廠的蘿卜泡菜的總酸含量較低，從60d時(shí)開始迅速升高，直至240d達(dá)到最高點(diǎn)，pH則與總酸含量趨勢相反，在整個(gè)發(fā)酵過程中逐漸降低，到發(fā)酵終止時(shí)在4.0左右。由圖1-a、圖1-b可知，0d時(shí)J廠母水的pH(6.37)要高于W廠(5.30)，J廠總酸含量(1.33g/kg)卻高于W廠(0.06g/kg)，猜測與2個(gè)工廠的蘿卜在封池前堆放的時(shí)間有關(guān)。鹽度在一定

9、程度上決定了泡菜的品質(zhì)。由圖1-c、圖1-d可知，發(fā)酵前60d，兩廠蘿卜泡菜的鹽度不斷增加，最高到15%左右，隨后基本維持穩(wěn)定，但J廠的鹽度始終高于W廠，這會(huì)抑制一些不耐鹽微生物的生長，導(dǎo)致兩廠真菌群落結(jié)構(gòu)的差異。亞硝酸鹽含量在兩廠的蘿卜泡菜中均呈波動(dòng)變化的趨勢，發(fā)酵后期基本維持在8.34mg/kg(J廠)和5.44mg/kg(W廠)，低于國標(biāo)中的20mg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)。除0d外，J廠的亞硝酸鹽含量均高于W廠。有機(jī)酸是四川泡菜發(fā)酵中的重要呈味物質(zhì)，且與微生物代謝活動(dòng)密切相關(guān)。兩廠蘿卜泡菜發(fā)酵過程中的有機(jī)酸含量變化如表1所示，共檢測到7種有機(jī)酸，其中，含量最高的是來自蘿卜泡菜原料中的草酸。隨著

10、發(fā)酵的進(jìn)行，蘿卜和母水中存在的豐富微生物開始生長代謝，草酸被不斷分解,含量逐漸降低，而乳酸和乙酸含量明顯增加，并且在發(fā)酵后期乳酸濃度是所有有機(jī)酸中最高的。這和工業(yè)豇豆泡菜15的研究結(jié)果一致。240d時(shí)J廠的乳酸含量增加到9.82g/kg，占整個(gè)有機(jī)酸總量的29.13%，W廠到240d時(shí)乳酸含量為5.64g/kg，占24.73%。蘿卜泡菜在發(fā)酵120d時(shí)才產(chǎn)生酒石酸，隨后J廠酒石酸含量從0.31g/kg增加到1.93g/kg，W廠則在3.83g/kg處小幅波動(dòng)。檸檬酸和琥珀酸在兩廠的發(fā)酵過程中均呈先增加再減少的趨勢，而有較大差異的蘋果酸在J廠含量最高為2.82g/kg(120d)，在W廠為1.7

11、1g/kg(240d)。a-TTA；b-pH；c-鹽度；d-亞硝酸鹽含量圖1工業(yè)蘿卜泡菜發(fā)酵過程中TTA、pH、鹽度及亞硝酸鹽含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.1DynamicchangesofTTA,pHandthecontentsofsalinity,nitriteduringthefermentationofindustrialradishpaocai表1工業(yè)蘿卜泡菜發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化單位：g/kgTable1Changesoforganicacidcontentsduringthefermentationofindustrialradishpaocai注：“-”表示未檢測到;不同小寫字母表

12、示差異顯著(P0.05)2.2Alpha多樣性分析通過IlluminaMiseq測序，為了保證樣本測序序列的均一性，對所有樣品有效序列按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平(每個(gè)樣本45629條有效序列)。抽平后，所有樣品序列歸屬于12個(gè)門，37個(gè)綱，74個(gè)目，176個(gè)科，299個(gè)屬，480個(gè)種。Alpha多樣性指數(shù)，包括Chao1、Simpson、Shannon和Goodscoverage，常用于表征在環(huán)境中微生物群落的豐富度以及多樣性情況。每個(gè)樣品的Goodscoverage值均達(dá)0.9999，表明測序深度良好，可以較真實(shí)展示樣品中的絕大多數(shù)真菌的群落結(jié)構(gòu)(表2)。J廠蘿卜泡菜的Chao1指數(shù)隨著發(fā)酵的

13、進(jìn)行先增加后減少，在發(fā)酵60d時(shí)真菌群落豐富度達(dá)到最高。而W廠發(fā)酵第0天的Chao1指數(shù)最大且高于J廠，表明W廠在發(fā)酵第0天真菌群落豐富度最高，經(jīng)過發(fā)酵作用后菌群豐富度有所降低。J廠的Simpson和Shannon指數(shù)值隨著發(fā)酵呈下降趨勢，W廠的真菌群落多樣性變化趨勢則與豐富度類似，這可能是由于不同工廠發(fā)酵初始母水的酸度和鹽度不同。2.3Beta多樣性分析在真菌操作分類單元(operationaltaxonomicunit,OTU)分類水平上，對J廠和W廠不同發(fā)酵時(shí)期蘿卜泡菜樣品進(jìn)行主成分分析(圖2)，以樣本點(diǎn)之間的距離來衡量其真菌群落結(jié)構(gòu)組成的相似或差異程度。不同樣本真菌群落結(jié)構(gòu)信息主要集中

14、在前3個(gè)主成分，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為84.45%，PC1的貢獻(xiàn)率為49.18%，PC2的貢獻(xiàn)率為24.43%。其中，PC1可以區(qū)分不同發(fā)酵時(shí)間工業(yè)蘿卜泡菜真菌群落結(jié)構(gòu)的差異性，PC2可以區(qū)分不同工廠的工業(yè)蘿卜泡菜樣品。分析發(fā)現(xiàn)36個(gè)樣品出現(xiàn)明顯的聚類趨勢，可將整個(gè)發(fā)酵過程分為發(fā)酵起始點(diǎn)(0d)、前期(3060d)、中期(60180d)和后期(180240d)。表2Alpha多樣性指數(shù)分析Table2TheanalysisofAlphadiversityestimators圖2工業(yè)蘿卜泡菜真菌群落主成分分析Fig.2Principalcomponentanalysisoffungicommunit

15、ystructureinindustrialradishpaocai2.4真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性和演替規(guī)律分析在門水平上，各廠不同發(fā)酵時(shí)期蘿卜泡菜樣品真菌群落組成如圖3-a所示。去除未分類的真菌后，所有樣品中真菌群落共包含10個(gè)門，其中子囊菌門(Ascomycota)為絕對優(yōu)勢菌門，相對豐度為42.7%99.9%。其次為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，其相對豐度為0.01%56.9%，這與吳進(jìn)菊等16在發(fā)酵大頭菜的研究結(jié)果一致。在兩個(gè)不同工廠蘿卜泡菜中，擔(dān)子菌門在發(fā)酵前期相對豐度較高，且均呈先增后減的趨勢，W廠發(fā)酵第0天和第30天擔(dān)子菌門的相對豐度超過50%，而J廠在第0天時(shí)相對豐度僅為4

16、.58%，隨后增加到27.66%(30d)。發(fā)酵到120、180、240d時(shí)，則子囊菌門(99%)主導(dǎo)了整個(gè)發(fā)酵中后期。在兩廠36個(gè)蘿卜泡菜樣品中共鑒定出230個(gè)屬，其中樣品J60-2檢測到屬水平微生物數(shù)量最多(106個(gè))，W120-3檢測到屬水平微生物數(shù)量最少(5個(gè))。選取其相對豐度較高的前20個(gè)優(yōu)勢屬(至少占每個(gè)樣品總相對豐度85%以上)，包括假絲酵母屬(Candida)、Starmerella、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、Tausonia、梗孢酵母屬(Sterigmatomyces)和畢赤酵母屬(Pichia)，各廠蘿卜泡菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢屬的動(dòng)態(tài)變化如圖3-b所示。假絲酵

17、母屬在兩廠發(fā)酵過程相對豐度中先減后增，蘿卜泡菜發(fā)酵前期的優(yōu)勢屬為德巴利氏酵母屬，假絲酵母屬和德巴利氏酵母屬是泡菜中常見的真菌屬17-18。a-門水平；b-屬水平圖3門水平及屬水平上工業(yè)蘿卜泡菜真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性Fig.3Diversityoffungalcommunitystructureofindustrialradishpaocaibasedonphylumandgenuslevel由圖3-b可知，J工廠蘿卜發(fā)酵過程優(yōu)勢菌屬為假絲酵母屬(3.02%99.38%)、德巴利氏酵母屬(0.05%64.83%)、畢赤酵母屬(0.04%33.01%)和Starmerella(0.04%72.75%)

18、。發(fā)酵第0天，假絲酵母屬(57.84%)和畢赤酵母屬(33.01%)為J廠母水中的優(yōu)勢微生物，隨后顯著下降，同時(shí)德巴利氏酵母屬迅速成為發(fā)酵前期的優(yōu)勢屬。Starmerella在發(fā)酵120d相對豐度很高(72.75%)，隨后減少。畢赤酵母屬是J工廠蘿卜0d特有的優(yōu)勢真菌屬，適合在弱酸環(huán)境中生存，也具有一定的產(chǎn)膜能力19；Starmerella在以往泡菜的研究中很少出現(xiàn)，在發(fā)酵葡萄酒中出現(xiàn)較多，對腐敗微生物有一定的抑制能力20。由圖3-b可知，W工廠蘿卜發(fā)酵過程優(yōu)勢菌屬為梗孢酵母屬(0.04%43.88%)、假絲酵母屬(0.26%44.76%)、德巴利氏酵母屬(0.29%84.13%)、Tauso

19、nia(0.09%56.68%)和Starmerella(0.25%97.92%)。與J廠不同的是，W廠發(fā)酵第0天物種豐富度最高，且優(yōu)勢真菌屬為梗孢酵母屬(43.88%)。發(fā)酵前期除德巴利氏酵母屬外，Tausonia在30d相對豐度占56.68%，隨后驟降。Starmerella在發(fā)酵中期為絕對優(yōu)勢真菌屬(97.92%)，后期隨著假絲酵母屬的活躍而相對豐度略有降低。梗孢酵母屬和Tausonia分別是W工廠蘿卜0、30d特有的優(yōu)勢真菌屬，其中梗孢酵母屬在白酒大曲和紅曲醋醅中有報(bào)道出現(xiàn)21-22，Tausonia在土壤微生物的報(bào)道中出現(xiàn)過23-24，可能是新鮮蘿卜本身攜帶進(jìn)入發(fā)酵池。2.5真菌群落

20、和理化因子關(guān)聯(lián)性分析將不同工廠蘿卜泡菜4個(gè)理化指標(biāo)(pH、TTA、鹽度、亞硝酸鹽)和7種有機(jī)酸作為環(huán)境因子，同時(shí)各自選取相對豐度較高的10個(gè)真菌屬，進(jìn)行冗余分析(redundancyanalysis,RDA)，分析結(jié)果見圖4。在RDA圖中各環(huán)境因子箭頭越長表示對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響越大。箭頭連線與排序軸的夾角以及箭頭連線之間的夾角表示相關(guān)性，銳角表示正相關(guān)，鈍角表示負(fù)相關(guān)25。TTA(45.3%)和pH(29.1%)對J廠蘿卜泡菜發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大，TTA與假絲酵母屬呈顯著正相關(guān)(P0.05)，檸檬酸與德巴利氏酵母屬呈顯著正相關(guān)；酒石酸(51%)是驅(qū)動(dòng)W廠蘿卜泡菜真菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要因素，草酸與Tausonia呈顯著正相關(guān)。總的說來，pH、鹽度、檸檬酸和草酸與發(fā)酵前期的真菌