Lowry法檢測蛋白質(zhì)含量

1、Lowry法檢測蛋白質(zhì)的含量蛋白含量檢測的方法11凱氏定氮法凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。蛋白質(zhì)是含氮的有 機化合物。蛋白質(zhì)與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫 酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn) 溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，并換算成蛋白質(zhì)含量。由于蛋白質(zhì)含 氮量比較恒定，可由其氮量計算蛋白質(zhì)含量，故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法。1.2雙縮脲法雙縮脲法是一個用于鑒定蛋白質(zhì)的分析方法。雙縮脲試劑是一個堿性的含銅 試液，呈藍色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配制。當(dāng)?shù)孜镏?含有肽鍵時（多肽），試液中的銅與

2、多肽配位，配合物呈紫色。紫色絡(luò)合物顏色 的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可通過比 色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應(yīng)的靈敏度為5-160mg/m 1。鑒定反應(yīng)蛋白質(zhì)單位1-10mg。此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。 主要的缺點是靈敏度差，不適合微量蛋白的測定。1.2.1雙縮脲反應(yīng)雙縮脲（NH2CONHCONH2，是兩個分子脲經(jīng)180C左右加熱，放出一個分 子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與二價銅離子形成紫色絡(luò)合物，稱 為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能夠以一個中間碳 原子相連

3、的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。1.3紫外吸收法蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋 白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值） 與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正 比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進 行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度 的鹽，例如生化制備中常用的（NH4） 2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。此 法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋 白質(zhì)含量時，對那些與標(biāo)準(zhǔn)

4、蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。1.4考馬斯亮藍法考馬斯亮藍G-250 (Coomassie brilliant blue G-250 )測定蛋白質(zhì)含量屬于染 料結(jié)合法的一種。在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié) 合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值 與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍 G-250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室 溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便 快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowr

5、y法還高4 倍, Bradford法測定蛋白濃度不 受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃 度范圍為01 000yg/mL，最小可測2.5yg/mL蛋白質(zhì)，是一種常用的微量蛋白 質(zhì)快速測定方法?？捡R斯亮藍G250染料試劑由考馬斯亮藍G250、乙醇、磷酸組成。用于考 馬斯染料結(jié)合(Bradford)分析的總蛋白測量。其特點在于對蛋白樣品中可能存在 的大多數(shù)鹽、溶劑、緩沖液、硫醇、金屬螯合劑、還原性物質(zhì)等均不排斥。Coomassie G-250PROTEINQCHjCHjBLUEProtein Coomassie G-250PROTEINQCHjCHjBLUEPro

6、tein - DyeCo m：plexAcid1.5 Folin酚(Lowry)法(增加試劑圖片)Lowry法系根據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cu2+螯合形成蛋 白質(zhì)-銅復(fù)合物，此復(fù)合物中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基使酚試劑的磷鉬酸鹽-磷鎢 酸鹽還原，產(chǎn)生藍色化合物，該藍色化合物在波長650nm處的吸光度與蛋白質(zhì) 含量成正比，根據(jù)蛋白樣品的吸光度，計算蛋白樣品的蛋白質(zhì)含量。Lowry法可 檢測的最低蛋白質(zhì)含量達5mg，通常測定范圍是20250mg。151蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是有機大分子，是構(gòu)成細胞的基本有機物，是生 命活動的主要承擔(dān)者。沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組

7、成單位。 它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)。機體中的每一個細 胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)參與。蛋白質(zhì)占人體重量的16%20%，即一 個60kg重的成年人其體內(nèi)約有蛋白質(zhì)9.612kg。人體內(nèi)蛋白質(zhì)的種類很多，性 質(zhì)、功能各異，但都是由20多種氨基酸(Amino acid)按不同比例組合而成的, 并在體內(nèi)不斷進行代謝與更新。蛋白質(zhì)是由氨基酸以“脫水縮合”的方式組成的多 肽鏈經(jīng)過盤曲折疊形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。蛋白質(zhì)中一定含有碳、氫、氧、氮元素。蛋白質(zhì)是由a氨基酸按一定順序結(jié)合形成一條多肽鏈，再由一條或一條以 上的多肽鏈按照其特定方式結(jié)合而成的高分子化合物。蛋白質(zhì)就是

8、構(gòu)成人體組織 器官的支架和主要物質(zhì)，在人體生命活動中，起著重要作用，可以說沒有蛋白質(zhì) 就沒有生命活動的存在。1.5.2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是以氨基酸為基本單位構(gòu)成的生物高分子。蛋白質(zhì)分子上氨基酸的序 列和由此形成的立體結(jié)構(gòu)構(gòu)成了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性。蛋白質(zhì)具有一級、二級、 三級、四級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)決定了它的功能。一級結(jié)構(gòu)(primary structure)：氨基酸殘基在蛋白質(zhì)肽鏈中的排列順序稱為 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，每種蛋白質(zhì)都有唯一而確切的氨基酸序列。二級結(jié)構(gòu)(secondary structure)：蛋白質(zhì)分子中肽鏈并非直鏈狀，而是按一 定的規(guī)律卷曲(如a-螺旋結(jié)構(gòu))或折疊(如卩-折疊結(jié)

9、構(gòu))形成特定的空間結(jié)構(gòu), 這是蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要依靠肽鏈中氨基酸殘基亞氨基(NH)上的氫原子和羰基上的氧原子之間形成的氫鍵而實現(xiàn)的。三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure)：在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，肽鏈還按照一定的空 間結(jié)構(gòu)進一步形成更復(fù)雜的三級結(jié)構(gòu)。肌紅蛋白，血紅蛋白等正是通過這種結(jié)構(gòu) 使其表面的空穴恰好容納一個血紅素分子。四級結(jié)構(gòu)(quaternary structure)：具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈按一定空間排列方 式結(jié)合在一起形成的聚集體結(jié)構(gòu)稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。如血紅蛋白由4個具有 三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈構(gòu)成，其中兩個是a-鏈，另兩個是卩-鏈，其四級結(jié)構(gòu)近似橢 球形狀。1

10、.5.3蛋白質(zhì)連接方法用約20種氨基酸作原料，在細胞質(zhì)中的核糖體上，將氨基酸分子互相連接 成肽鏈。一個氨基酸分子的氨基和另一個氨基酸分子的羧基，脫去一分子水而連 接起來，這種結(jié)合方式叫做脫水縮合。通過縮合反應(yīng)，在羧基和氨基之間形成的 連接兩個氨基酸分子的那個鍵叫做肽鍵。由肽鍵連接形成的化合物稱為肽。1.5.4氨基酸含有氨基和羧基的一類有機化合物的通稱。生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組 成單位，是構(gòu)成動物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)。是含有堿性氨基和酸性羧基的有機化合物。氨基連在a-碳上的為a-氨基酸。組成蛋白質(zhì)的氨基酸均為a-氨基 酸。20種氨基酸縮寫中文名稱英文名稱三字母縮寫單字母符號甘氨酸Glyc

11、ineGlyG丙氨酸AlanineAlaA纏氨酸VaiineVaiV亮氨酸LeucineLeuL異亮氨酸IsoleucinelieI脯氨酸ProLineProP苯丙氨酸Pheny_a_aninePheF酪氨酸TyrosineTyrY色氨酸TryptophanTrpW絲氨酸SerineSerS蘇氨酸ThreonineThrT半胱氨酸CystineCysC蛋氨酸MethionineMetM天冬酰胺AsparagineAsnN谷氨酰胺GLutarnineGinQ天冬氨酸Aspart icac idAspD谷氨酸GlutamicacidGluE賴氨酸LysineLysK精氨酸ArginineArgR組

12、氨酸HistidineHisH1.5.5吸光光度法吸光光度法是基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法，包括比色 法、可見及紫外吸光光度法及紅外光譜法。吸光光度法是采用分光器獲得純度較 高的單色光，基于物質(zhì)對單色光的選擇性吸收測定物質(zhì)組分的分析方法。吸光光 度法是借助分光光度計測定溶液的吸光度，根據(jù)朗伯一比耳定律確定物質(zhì)溶液的 濃度。吸光光度法是比較有色溶液對某一波長光的吸收情況。OD值OD值(optical density)表示某一物質(zhì)在某一個特定波長下的吸光度；ABS是 吸光值absorbance的縮寫。在分析化學(xué)里，某一化學(xué)物質(zhì)都可吸收一定波長的 光，并且對光的吸收度與此化學(xué)物質(zhì)的濃

13、度成正比。因此可以利用吸光度的大小 來測定某種物質(zhì)的濃度。其中某物質(zhì)在特定波長下對光的吸收度，就是OD值， 一般用經(jīng)過石英管后的光強比上照射到石英管前的光強來表示。吸光度值（abs/AU）定義吸光度，absorbance，是指光線通過溶液或某一物質(zhì)前的入射光強度與該光 線通過溶液或物質(zhì)后的透射光強度比值的對數(shù)，影響它的因素有溶劑、濃度、溫吸光系數(shù)與入射光的波長以及被光通過的物質(zhì)有關(guān)，只要光的波長被固定下 來，同一種物質(zhì)，吸光系數(shù)就不變。當(dāng)一束光通過一個吸光物質(zhì)（通常為溶液）時，溶質(zhì)吸收了光能，光的強度 減弱。吸光度就是用來衡量光被吸收程度的一個物理量。吸光度用A表示。A=abc，其中a為吸光系

14、數(shù)，單位L/（gcm）,b為液層厚度（通常為比色皿的 厚度），單位cm，c為溶液濃度，單位g/L影響吸光度的因數(shù)是b和c。a是與溶質(zhì)有關(guān)的一個常量。此外，溫度通過 影響c,而影響A。符號A,表示物質(zhì)對光的吸收程度。97801式中10是通過均勻的液體介質(zhì) 的一束平行光的入射光的強度；It是透射光強度；T是透射比。A值越大，表示 物質(zhì)對光的吸收越大。根據(jù)比爾定律，吸光度與吸光物質(zhì)的量濃度c成正比，以 A對c作圖，可得到光度分析的校準(zhǔn)曲線。在多組分體系中，如果各組分的吸光 質(zhì)點彼此不發(fā)生作用，那么吸光度便等于各組分吸光度之和，這一規(guī)律稱吸光度 的加和性。據(jù)此可以進行多組分同時測定及某些化學(xué)反應(yīng)平衡常

15、數(shù)的測定。在吸 光度測定中，為抵消吸收池對入射光的吸收、反射以及溶劑、試劑等對入射光的 吸收、散射等因素，可選用雙光束分光光度計，并選光學(xué)性質(zhì)相同、厚度相等的 吸收池分別盛待測溶液和參比溶液。156朗伯比爾定律又稱比爾定律、比耳定律、布格-朗伯-比爾定律，是光吸收的基本定律，適 用于所有的電磁輻射和所有的吸光物質(zhì)，包括氣體、固體、液體、分子、原子和 離子。比爾-朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光電比色法的定量基礎(chǔ)。朗伯比爾定律闡述為：光被透明介質(zhì)吸收的比例與入射光的強度無關(guān)；在光 程上每等厚層介質(zhì)吸收相同比例值的光。朗伯比爾定律數(shù)學(xué)表達式A=lg（1/T）=KbcA為吸光度，T為透射比，是透

16、射光強度比上入射光強度K為摩爾吸收系數(shù). 它與吸收物質(zhì)的性質(zhì)及入射光的波長久有關(guān)。c為吸光物質(zhì)的濃度b為吸收層厚度。Lorwy法實驗材料和用具2.1儀器與試劑試劑：無水碳酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀、硫酸銅、福林酚試劑、牛血清白 蛋白（BSA）。儀器：SP-756P紫外分光光度計。常用玻璃器皿：量筒、試管、玻棒等。2.2實驗步驟2.2.1溶液配制：（1）4%碳酸鈉溶液稱取4g無水碳酸鈉，加水溶解使成100ml。（2）0.8氫氧化鈉溶液稱取0.8g氫氧化鈉，加水溶解使成100ml。（3）0.1mol/L酒石酸鉀稱取2.35g酒石酸鉀，加水溶解使成100mL。（4）0.04mol/L硫酸銅溶液稱取1g

17、硫酸銅（CuSO45H2O）,加水溶解使成100mL。（5）堿性銅試劑取試劑4%碳酸鈉溶液、0.8%氫氧化鈉溶液各25mL，試劑0.1mol/L酒石酸 鉀、0.04mol/L硫酸銅溶液各0.5ml混合配制而成。2.2.2蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)貯備液（1mg/ml）稀釋成100yg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液。2.量取標(biāo)準(zhǔn)工作液（雙份）0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分別加入刻度試管中, 補水至1ml。試管號空白（2管）1、23、45、67、89、10蛋白量（yg）020406080100標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液量（yl）02004006008001000超純水量（yl）1000

18、8006004002000蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液配置表12.2.3操作步驟精密量取供試品和陽性對照1.0ml （雙份）于刻度試管中；吸取1.0ml純化 水作為空白對照。加堿性銅溶液5.0ml到每一管中，渦旋混勻，室溫條件放置10分鐘。加酚試劑0.5ml，搖勻，室溫放置30分鐘。使用紫外分光光度計在650nm處用空白對照調(diào)零后，測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光 度值，以及供試品和陽性對照的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和其對應(yīng)吸光度的 標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算供試品和陽性對照的蛋白含量。紫外-可見分光光度法（增加分光光度計的圖片）是根據(jù)物質(zhì)分子對波長為200-760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立 起來的一種定性、定量和結(jié)構(gòu)分析方法。操作簡單、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。波長 長（頻率?。┑墓饩€能量小，波長短（頻率大）的光線能量大。分光光度測量是 關(guān)于物質(zhì)分子對不同波長和特定波長處的輻射吸收程度的測量。描述物質(zhì)分子對輻射吸收的程度隨波長而變的函數(shù)關(guān)系曲線，稱為吸收光譜 或吸收曲線。紫外-可見吸收光譜通常由一個或幾個寬吸收譜帶組成。最大吸收 波長（九max）表示物質(zhì)對輻射的特征吸收或選擇吸收，它與分子中外層電子或 價電子的結(jié)構(gòu)（或成鍵、非鍵和反鍵電子）有關(guān)。朗伯-比