分離菌的各種培養(yǎng)基

1、人造海水的配方*(引自 Chemical Oceanography ,Second Edition , Millero F J,1996 ) *：水化合物的總重量為 1kg.名稱質量(X10-3cg)氯化鈉23.98氯化鎂5.029硫酸鈉4.01氯化鈣1.14氯化鉀0.699重碳酸鈉0.172溴化鉀0.100硼酸0.0254氯化鍶0.0143氟化鈉0.0029?fi water； ASWh 人工悔的組戒(Lymnn and Fleming, 1940)如下&MaCl24.477(?M 電 30*3.9170fiCflCli-HjOf.1020bKC10.6640fi0.!920gKBr0血勉S

2、i120024(NaFmoo婭離tB水1 OOOnil為了避免沉淀的產生.人工海感的各成分需聲分別溶解，然后再混合F pH$7.5,可以用濃的氫氟化鈉或鹽酸來調節(jié)p用以上人工梅水代替天然悔水大大方便了實驗室條件下對真菌的培養(yǎng).使海海洋微生物及其代謝產物 -林永成主編 2003 細菌的分離： 牛肉膏蛋白胨瓊脂、營養(yǎng)瓊脂等是分離細菌的常用培養(yǎng)基，前蘇聯(lián)細菌學家設計的 ZOBELL 2216E培養(yǎng)基是培養(yǎng)好氣性異養(yǎng)細菌較好的培養(yǎng)基，可培養(yǎng)多種細菌，SIMIDU培養(yǎng)基也常 用于海洋好氣性異養(yǎng)細菌的分離， PFENNIGS 培養(yǎng)基適用于海洋光合細菌的分離，分離海洋 弧菌可采用TCBS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基PH

3、一般為72-7 6,鹽度為28到30,培養(yǎng)溫度28到37, 培養(yǎng)時間 1 到 7 天，注意觀察平板菌落變化， 1 到 2 天先挑取大菌落， 5到 7 天后再挑取小 菌落，為防止真菌的污染，常在培養(yǎng)基中添加一定的抗真菌抗生素，如制霉菌素、兩性霉素、 放線菌酮等。放線菌因生長緩慢且菌落不大，一般不會對細菌的分離產生影響。放線菌的分離：放線菌是數(shù)量最多、最常分離到的 G+， JENSEN 的研究表明，離海岸越近，在 0 到 1 米水 深的底泥樣本中，鏈霉菌占分離的放線菌總數(shù)的 86%，小單孢菌占 12%，其他占 2%。分離培養(yǎng)基多采用合成培養(yǎng)基（高氏合成一號、精氨酸、天門冬素培養(yǎng)基）和有機培養(yǎng)基（H

4、V、YE、WAKSMAN、 bennett）, 高氏合成一號是分離的常用培養(yǎng)基，適合尤其是鏈霉菌的生長，但細菌和真菌也 大量生長。HV是以腐植酸為唯一碳、氮源的培養(yǎng)基，對小單抱菌、小雙抱菌、指抱囊菌、 鏈孢囊菌的選擇性高，但是生長的放線菌形態(tài)不完整，難以觀察，給挑菌工作帶來困難。抑制劑放線菌酮、制霉菌素可抑制真菌，青霉素、鏈霉素可抑制細菌，重鉻酸鉀對真菌和細菌均可 抑制，0005%-001%是較理想的分離抑制劑，有三個特點：抑制細菌和真菌的生長，不影 響放線菌的正常生長，還可促進一些放線菌孢子的萌發(fā)，價格低廉。樣品預處理120 干熱處理樣品 1 小時能大大減少細菌和鏈霉菌的數(shù)量，而對稀有放線菌

5、影響較少，甚至能利于孢子萌發(fā)，由于海洋樣品多潮濕，同時孢子對濕熱敏感，故采用50到55度的熱處理 會促使大部分孢子萌發(fā)?；瘜W殺菌劑法殺菌劑苯酚SDS葡萄糖酸洗必泰CG芐索氯氨BC碳酸鈣氯化鈣富集的放線菌非鏈霉菌屬小單抱菌智囊抱菌小雙抱菌非鏈霉菌屬小四抱菌所有放線菌放線雙抱菌小四抱菌鏈抱囊菌差速離心 濃縮真菌的分離：到2000年止已認知的海洋真菌僅僅444種，包括177屬360種的子囊菌（占811%）, 51 屬74種半知菌（占167%）和7屬10種的擔子菌（占22%）選擇性富集海水樣品可通過濃縮或過濾，用無菌的045Mm孔徑的硝酸纖維素濾膜過濾海水，然后直接 把濾膜放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。分離酵母菌

6、時，可將含50-200 mg/L氯霉素的分離培養(yǎng)基用濃鹽酸調PH值至34酸性條 件下可抑制很多細菌生長。植物內生真菌分離方法： 進行分離前，對植物材料表面進行徹底消毒非常必要，典型的消毒劑有70%-90%的乙醇、漂 白劑、1%的過氧乙酸和3%-30%的過氧化氫，多采用PDA培養(yǎng)基，并加入慶大霉素、氯霉素、 鏈霉素等抗生素，抑制細菌和放線菌的生長。鑒定：16S rRNA 相對分子量適中，易于進行序列測定和分析比較，可以為細菌鑒定提供相對穩(wěn)定 可靠的信息，廣泛用于評價生物遺傳多態(tài)性和系統(tǒng)發(fā)生關系。18S rRNA成為目前研究真菌 屬物種多樣性的分析比較。原核微生物rRNA包含23S、16S、5S，

7、真核微生物轉錄區(qū)包含5S、 18S、 5 8S、 28S。（C+G）mol%在種內不超過4%,屬內不超過10%。低于2%沒有分內學意義。只具有否定價值， 需與表型特征相結合。16S rDNA成為細菌種屬鑒定和分類的標準方法，適用種及種以上的分類單位。同源性三95%的菌可歸為同一屬，三97%可視為同一種，大于97%時必須測定DNA-DNA雜交率 是否大于 70%才能確定是否為新種。由于對同種內的不同菌株分辨力較差，更適合研究屬及 屬以上的菌株。18S rDNA 普遍用于真菌物種的鑒定分析。植物內生真菌的分離 葉、葉脈、莖、樹皮（韌皮部）等樣品用自來水沖洗掉泥土，然后進行 嚴格的表面消毒程序：依次

8、浸泡在75%酒精lmin, 3%一5%有效氯的次氯酸鈉溶液3 min。75%的酒精0. 5min，然后再用無菌水沖洗3遍。晾干后，在超靜臺將其剪成約0. 5 cmX0. 5 cm左右小片。將處理好后剪成的小片鋪于PDA平板上，加入氯霉素與鏈霉素各50斗g/mL抑制 細菌的生長，在26C培養(yǎng)培養(yǎng)23周分離內生真菌。這些平板在第1周要每天檢查1次，然后 可以3、4d檢查1次。一旦發(fā)現(xiàn)有菌絲從組織小塊長出，應馬上將其轉接到另一新的平板上， 經(jīng)幾次純化保存于PDA斜面。植物組織樣品處理: 將采集的紅樹林植物樣品先用流動的清水沖洗干凈,再超聲清洗徹底去 除植物組織表面的雜質, 把植物樣品剪切成15 cm

9、 左右長度的節(jié)段進行表面消毒。樣品依次 用次氯酸鈉（含5%有效氯量）浸泡5 min,無菌水清洗3次，75%酒精浸泡3 min,無菌水清洗3 次，晾干，用粉碎機把植物組織粉碎備1.3, 1各種樣詰預處理方袪樣品懸浮液的直接制備;稱取2 g樣品海生動植物休用無菌剪刀剪碎）到20 nd的無菌海水中，旋渦掘蕩10就幾 使其充分混懸SDS法處理樣品恂剛稱取2呂樣品海生動植物體用無菌剪ZJ剪碎）到20 mL含有0. 05 % SDS和 %酵母膏的無菌海水中，振蕩3-5min后，豹200 rmi下振蕩30 min.苯酚法駁理樣品闿:稱取2官樣品（海生動植物體用無茵剪刀剪碎）到含有1. 5 %苯酚的20機 的

10、無菌海水中+振蕩3-5 min后，30YJ. 200 rmin1下 振蕩30 mi恥加熱法處理樣品陽門h將直接制備好的樣品懸浮液55C水浴6 min.（或aorr i h）注竜：樣品處理的輕個過程必須是無菌的表1-1菌種分隔師逸所用到的培養(yǎng)基名稱配方%酵母粉-圭牙膏瓊脂(YE1 1121酵母粉0 4麥芽臂1,葡苗轉0.4,瓊脂出陳海 水咫 蒸謂水25, pH； L 2-7.4魂粉-干酩素瓊脂(SC) m可涪性淀粉L 卡酪索0.03. KMOi 0.2%, NaClOh 2,?；?0.2,血沖 弧。O.CMJ5r CaCOi0.002h PeSO. 0.001p 瓊脂 2,放線菌酣 75piw

11、陳75,煎惰水 25. pH: 7. 2-7.4伺萄糖-天門窯醴氨tW J,天門轡醜氧CL05,磷酸氫二鉀0.05,瓊脂CGA)仙小瓊脂N陳海吒,蒸悝水跡，pH: 7.2-7. 4腐殖酸-維生素瓊脂HV網(wǎng)腐殖酸 0, 1, 阪HPCk 0.005, KC1 0 17 .嗨56 7也0 0. 005. FeSOi * 711*0 6 001,CaCQ,0.GQ2 n硫胺素500 ppm,核黃索250 ppm,肌醇：?C;0 ppm,泛酸 5&0 ppm 對短基竝酸 5DO ppp ,憑物素500 ppm.維生黑BtSOO ppn,泛酸500阿，煙酸500 口呱 瓊脂2,陳海水75.蒸憾*皈 pH

12、:7,2-7. 4淀粉蛋白豚瓊脂(Ml)何可溶性淀粉0,25.雪白陳仃酵母0.05 廿油織酸一鈉0.01,球脂站陳海忒閒蒸博水PH7, 2-7.4葡萄糖-蛋白陳(Martin) ,H葡萄糖L.CL資白關&乩MP0. L0tMSOJEW 0.05,瓊脂 2,pH:7. 2-7A淀粉-苛豆粉液體發(fā)酚堵養(yǎng)建可溶性淀粉占 黃豆粉抽握物1.5,(SLM) 1,41醇毋粉0 5. CaCO, 0.4,陳海水75.蒸詡水2氐pM:7. 2-7.4O) HV的配制：稱取腐植議.加 嘆的1LCL,煮沸石過濾取上清：各種維生索導培養(yǎng)基其 他成分開滅葡，倒皿前DO入n以上培養(yǎng)基除GA要求115匸下.天菌30 mir

13、.外其余培養(yǎng)基詢是1211C,滅菌21 mirio加入750 ppm放線菌酮的YE. SC. GA. HV用于涂布預捷理后的樣品；加入100 卩阿重鋸酸押的YE. Gause用于施格醴鉀選擇法，不加任何抑制劑或抗生素的YE、SC.GA. HV柞為對照.不加任何抑制劑或抗生素的E斜而用來保藏放線菌和真藺2.22.1分離培養(yǎng)基2216E培養(yǎng)曜：Yeast extract1 gPeptoneAgar5g2%FePO4 陳海水配制0.1 g1000 mLISP3培養(yǎng)基：Oatmeal20 gTrace salt solution1 mLAgar2%蒸館忒lOOOmLpH7.2Trace slt sol

14、ution：FeSO7H2O0.1 gMnCl2.4H2O01 gZnSO7H2O0.1 g去離子水100 mL察氏培養(yǎng)基；NaNO32gKjHPO*1KCl0-5 gMgSCh0.5 gFcSOj0.01 g朮糖30 EAgar2%蒸館水1000 mLPH7*2GYM培養(yǎng)棊；Glucose4gYeast extractMalt extract10 gAgar2%蒸帽水1000 mLpH7.2兒丁質培養(yǎng)基：K2HPO405呂MgSOUHO02 gFeSO4-7H:O0.01 gGlucosef火菌后加入）10 g幾丁質imAgar2%lOOOinLpH72HV培養(yǎng)基七腐植酸1 gNa:HPO4

15、OSgKC1FeSO7H2O10 mgMgSO4.7H2O20 gCaCh002 g核黃素0.5 mg肌哮0.5 mg對氨基苯甲酸0.5 mg生物素0.25 mg煙酸0.5 mg泛酸0.5 mg維生素B60,5 mg硫胺素0-5 mgAgar2%蒸ts水1000 mLpH7.2H純化培養(yǎng)基高氏號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20gKHPm0-5 gMgS04.7H2（）0.5 gNaCl0.5 gNaNO31.0 gF?SOj0.01 g瓊脂2%蒸脩水1000 mLpH7.22.223發(fā)酵培養(yǎng)基TSB培養(yǎng)基（上海中科昆蟲生物技術開發(fā)有限公司）:胰蛋白豚17.0大豆蛋白臟NaCl5.0 g25 gKH2PO

16、42.5 蒸ta水1000 mL消前 pH 7.0-72發(fā)酵塔養(yǎng)基可溶性淀粉20 黃豆講粉葡萄糖5g酵毋提取物2.5 CaCCh5 gNaCI5g蒸憾水1000 mL州7t2M 2-4培養(yǎng)縱Table 2-4 Cultuie medium名稱配方HL1培養(yǎng)基67.Og酵母氯源(Yeast Nitrogen Base. Difco)和ltWin呂酩蚩門水胖物(Casainino acid, Difco -酒IL Sf佛水中過濾陳I禮 卅1詢該落 液巾加入無菌的斶酸氧二卻辭液.| T- 2% ：.jI；： ： 121 U . 20iuin) | A IOOiuL I：述狂木冷菲基即叫.HL2 養(yǎng)基価肺抽1咋蚩白陳冶 臍蚩門腕圮 Nacl5g.瓊脂羽g. lOOO