消痰通腑方對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞磷脂酶A2、環(huán)氧合酶2表達(dá)及細(xì)胞生物

1、消痰通腑方對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞磷脂酶A2、環(huán)氧合酶2表達(dá)及細(xì)胞生物消痰通腑方對結(jié)腸癌S480細(xì)胞磷脂酶A2、環(huán)氧合酶2表達(dá)及細(xì)胞生物學(xué)行為的影響結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在男性和女性中分別位居第3位和第2位，且有逐年上升趨勢1。結(jié)腸癌屬中醫(yī)學(xué)腸蕈范疇，多因飲食失節(jié)、脾胃受損、濕熱壅聚成痰而搏結(jié)腸腑所致。消痰通腑方為魏品康教授從痰論治消化道腫瘤核心治那么消痰散結(jié)八法之一。磷脂酶A2phsphlipaseA2，PLA2是一類可催化脂肪酸水解并產(chǎn)生以花生四烯酸arahidniaid，AA為主的游離脂肪酸酶，具有產(chǎn)生炎性介質(zhì)、參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能，在人類腫瘤發(fā)生、開展中發(fā)揮重要生物效應(yīng)2

2、。環(huán)氧化酶ylxygenase，X是PLA2催化AA生成生物活性分子的限速酶，包括X-1和X-2。研究說明，X-2在結(jié)腸中過度表達(dá)，其與細(xì)胞增殖、分化等有關(guān)3。本研究采用消痰通腑方干預(yù)結(jié)腸癌S480細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞增殖、遷移的影響，討論其分子作用機(jī)制。1實(shí)驗(yàn)材料1.1細(xì)胞株人結(jié)腸癌S480細(xì)胞，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。1.2藥物及制備消痰通腑方由制半夏、制南星、大黃、陳皮、雞內(nèi)金、炙甘草組成，所有飲片由上海雷允上藥業(yè)提供。消痰通腑方由第二軍醫(yī)大學(xué)試劑中心制備，按比例制半夏15g，制南星15g，大黃6g，陳皮15g，雞內(nèi)金15g，炙甘草6g稱取10倍量的飲片，加8倍體積的75%乙醇，回流提取煎煮

3、2次，每次1h，將煎液合并后離心、濃縮、枯燥至干品即得消痰通腑方醇提物，其得率為1g原藥材/0.26g。等比例換算至藥物濃度分別為2.24、8.96g/L。實(shí)驗(yàn)前稱取適量醇提物干粉，經(jīng)渦旋、超聲、水浴等方法使其充分溶解于DE培養(yǎng)基后，0.22濾器過濾并配置成所需濃度的溶液，4冰箱貯存?zhèn)溆谩?.3主要試劑與儀器DE培養(yǎng)基，胎牛血清FBS，0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液，qPR、DNA反轉(zhuǎn)錄、總RNA提取試劑盒，transell小室，K8溶液，PLA2抗體，X-2抗體，PLA2shRNA質(zhì)粒，shRNA對照質(zhì)粒，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑，均購自Santaruz公司。超凈工作臺廣州深華生物技術(shù)，2

4、培養(yǎng)箱、BIATE型紫外可見分光光度計(jì)Ther，LXJ-A型離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠，GE4852型PR儀杭州柏恒科技，DYZ-24DN電泳儀北京六一儀器廠，Tan500全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)南京裴爾森生物科技。2實(shí)驗(yàn)方法2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)結(jié)腸癌S480細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS和1%青-鏈霉素雙抗DE培養(yǎng)基，每隔12d換液，待細(xì)胞交融約80%時(shí)進(jìn)展細(xì)胞傳代及種板。消痰通腑方原藥材濃度為8.96g/L，經(jīng)0.22無菌過濾器過濾，用培養(yǎng)基稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。實(shí)驗(yàn)根據(jù)藥物濃度分為對照組0g/L、低劑量組2.24g/L、高劑量組8.96g/L。2.2K-8法檢測取對數(shù)生長期上述3組細(xì)胞，經(jīng)胰酶消

5、化后，接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1103。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別于24、48、72、96、120h后加10LK-8溶液。置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，于酶標(biāo)儀波長450n處測定細(xì)胞吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞相對增殖率實(shí)驗(yàn)組A值-對照組A值對照組A值100%。2.3平板克隆形成實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長S480細(xì)胞懸液梯度倍比稀釋后，接種于6孔板中，每孔50個(gè)細(xì)胞。置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，各組分別參加各濃度消痰通腑方本文由論文聯(lián)盟.Ll.搜集整理溶液，重新置于培養(yǎng)箱中，經(jīng)常觀察，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)，棄去上清液，PBS清洗2次，甲醇溶液固定15in后加Giesa染液染色。計(jì)算克隆細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。2.4T

6、ransell小室實(shí)驗(yàn)搜集3組細(xì)胞，800r/in離心5in，PBS清洗2次，用培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為1109/L。分別取100L細(xì)胞液置于Transell小室上層，同時(shí)在下層加500LDE培養(yǎng)基。37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，擦凈小室濾膜上層的細(xì)胞。4%多聚甲醛固定10in，PBS清洗并用結(jié)晶紫染色。每組同時(shí)做3個(gè)重復(fù)小室，200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照。2.5RT-qPR檢測結(jié)腸癌S480細(xì)胞磷脂酶A2和環(huán)氧合酶2RNA表達(dá)從GeneBank網(wǎng)站獲取PLA2、X-2基因序列，并使用Preier5.0軟件設(shè)計(jì)引物見表1，引物由上海生工生物工程合成。采用Trizl試劑提取細(xì)胞總RNA，每份樣品均取2

7、g，按試劑盒說明進(jìn)展反轉(zhuǎn)錄。以Tubulin為內(nèi)參，PLA2、X-2表達(dá)的相對定量值用于統(tǒng)計(jì)分析。2.6esternblt檢測結(jié)腸癌S480細(xì)胞磷脂酶A2和環(huán)氧合酶2蛋白表達(dá)用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解并搜集細(xì)胞總蛋白，BA法檢測蛋白濃度后參加上樣緩沖液，煮沸變性。樣品進(jìn)展SDS電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2h后，特異性一抗4搖床過夜，洗膜后，二抗孵2h，E顯影。2.7shRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)人結(jié)腸癌S480細(xì)胞分為PLA2shRNA干擾組、質(zhì)粒對照組、對照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以2gPLA2shRNA質(zhì)粒和對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染S480細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后，用5g/L嘌呤霉素挑選細(xì)胞株，

8、繼續(xù)培養(yǎng)24h。對照組為不加任何處理的S480細(xì)胞。3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展分析。計(jì)量資料以xs表示，采用t檢驗(yàn)。P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4結(jié)果4.1消痰通腑方對結(jié)腸癌S480細(xì)胞增殖的影響高劑量組較對照組增殖才能明顯減弱P0.05，低劑量組也能抑制細(xì)胞增殖但效果不如高劑量組，結(jié)果見圖1。高劑量組克隆形成率為48.383.67%、低劑量組為121.132.64%，較對照組205.653.72%明顯降低P0.05，P0.01，結(jié)果見圖2。4.2消痰通腑方對結(jié)腸癌S480細(xì)胞侵襲才能的影響消痰通腑方作用48h，低、高劑量組較對照組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低P0.05，P0.01

9、。結(jié)果見圖3。4.3消痰通腑方對結(jié)腸癌S480細(xì)胞磷脂酶A2和環(huán)氧合酶2RNA和蛋白表達(dá)的影響消痰通腑方作用72h，PLA2、X-2RNA和蛋白表達(dá)量均顯著降低，與對照組比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05；高劑量組較低劑量組差異更顯著P0.05。結(jié)果圖4、圖5。4.4PLA2shRNA干擾后消痰通腑方對結(jié)腸癌S480細(xì)胞磷脂酶A2和環(huán)氧合酶2蛋白表達(dá)的影響PLA2shRNA干擾48h，與質(zhì)粒對照組和對照組相比擬，轉(zhuǎn)染PLA2shRNA質(zhì)粒的S480細(xì)胞PLA2蛋白表達(dá)明顯受到抑制，PLA2shRNA干擾成功。同時(shí)，X-2的表達(dá)與PLA2的表達(dá)具有一致性。結(jié)果見圖6。5討論中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，結(jié)腸癌多因飲食

10、失節(jié)，嗜食肥甘厚膩，困遏脾土，而致脾胃受損，脾運(yùn)化失常，濕濁內(nèi)生，氣機(jī)阻滯，精微不能正常布散而發(fā)玻濕聚為痰，熱煉津?yàn)樘担蕽駸巅站勰敲淳媚苌?，搏結(jié)腸腑，致腸腑濕熱重滯，氣機(jī)運(yùn)化不暢，大腸傳導(dǎo)失司，痰熱濕濁不能及時(shí)排除體外而在體內(nèi)停聚，日久形成積塊而成痰結(jié)4。消痰通腑方為魏品康教授從痰論治消化道腫瘤的經(jīng)歷用方。研究說明，該方可抑制炎癥因子引發(fā)的炎癥反響5-6。方中制半夏、制南星為消痰散結(jié)之君藥，大黃、炒枳實(shí)殼清熱通腑為臣藥，雞內(nèi)金、陳皮理氣消積，顧護(hù)脾胃為佐使，炙甘草調(diào)和藥性，共奏消痰散結(jié)祛除痰結(jié)、清熱通腑推陳出新。PLA2是磷脂代謝的關(guān)鍵酶之一，可分解磷脂產(chǎn)生AA從而進(jìn)一步產(chǎn)生X-2、前列腺素E2PGE2等炎性介質(zhì)，從而引發(fā)炎癥。研究說明，PLA2的活化與多種腫瘤相關(guān)7-9。慢性炎癥促進(jìn)腫瘤的發(fā)生開展涉及多條細(xì)胞內(nèi)信號通路，其中PLA2-X-2-PGE2信號通路是其重要途徑之一。研究說明，結(jié)直腸癌的開展常伴隨著X-2基因過度表達(dá)，其過度表達(dá)可通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活，進(jìn)而在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用10。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比擬，高劑量組能降低結(jié)腸癌細(xì)胞增殖才能P0.05，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移P0.01。低劑量組雖不如高劑量組效果好，但與對照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05。而且消痰通腑方能降低結(jié)腸癌S480細(xì)胞PLA2及X-2的表達(dá)，PLA2shRNA干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)一