博士后出站研究報(bào)告

1、分類號(hào)_密級(jí)_U D C_編號(hào)_南方醫(yī)科大學(xué)博士后研究工作報(bào)告結(jié)構(gòu)及功能性鑒定與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的二型膠原蛋白特異性、HLA-DRB1*0405 限制型 T 細(xì)胞表位Functional and Structural Characterization of anHLA-DRB1*0405-restricted T cell Epitope from Type II Collagen Relevant toRheumatoid Arthritis張娜茹工作完成日期2015 年 7 月至 2017 年 12 月報(bào)告提交日期2018 年 1 月南方醫(yī)科大學(xué)（廣東）12018 年 1 月2結(jié)構(gòu)及功能性

2、鑒定與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的二型膠原蛋白特異性、HLA-DRB1*0405 限制型 T 細(xì)胞表位Functional and Structural Characterization of an HLA-DRB1*0405-restricted T cellEpitope from Type II Collagen Relevant to Rheumatoid Arthritis博士后姓名：張娜茹流動(dòng)站（一級(jí)學(xué)科）名稱：藥理學(xué)專業(yè)（二級(jí)學(xué)科）名稱：抗炎免疫藥理學(xué)研究工作起始時(shí)間2015年 7 月 1 日研究工作期滿時(shí)間2017年 12 月 31 日南方醫(yī)科大學(xué)人事部（廣東）2018 年 1 月3內(nèi)容

3、摘要類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是由 T 細(xì)胞介導(dǎo)的與人類主要組織相容性復(fù)合物 II 類分子（MHC II）密切相關(guān)的一種自身免疫性疾病。位于東亞地區(qū)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者約 30-40%攜帶 HLA-DRB1*0405 等位基因。截至目前，二型膠原蛋白（CII）被認(rèn)為是引發(fā)該疾病的主要自身抗原之一，然而該蛋白的 T 細(xì)胞表位及它是如何與 HLA-DRB1*0405 分子結(jié)合進(jìn)而相互作用的尚未被科研工作者報(bào)道。通過多肽競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)了一條來源于 CII 的多肽 hCII931-949 與HLA-DRB1*0405 分子具有很高的結(jié)合力,然而已被證實(shí)的 HLA-DRB1*0401 分子的 T 細(xì)胞表

4、位 hCII259-273 并不能結(jié)合 HLA-DRB1*0405 分子。經(jīng)過 E266L位點(diǎn)的氨基酸替換 hCII259-273_E266L 與 HLA-DRB1*0405 分子的結(jié)合力大幅度增強(qiáng)。我們進(jìn)一步證實(shí)了 hCII931-949 與 HLA-DRB1*0405 分子的主要結(jié)合位點(diǎn)并得到了 DRB1*0405-hCII931-949 的晶體結(jié)構(gòu)。 CII 特異性，HLA-DRB1*0405 分子限制型 T 細(xì)胞表位的鑒定為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疫苗的研發(fā)和臨床應(yīng)用奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，主要組織相容性復(fù)合物，HLA-DRB1*0405, 二型膠原蛋白，T 細(xì)胞表位，4Abstra

5、ctRheumatoid arthritis is a T cell dependent autoimmune disease with a strong association with the major histocompatibility complex class II (MHC II) gene. Up to30-40% of the East Asian RA patients possess HLA-DRB1*0405 allel which is associated with the disease. A joint protein that has been sugges

6、ted to play a role in the onset of arthritis is type II collagen (CII) but it is so far unknown how the relevant peptide is bound and recognized when presented by HLA-DRB1*0405 allele. We have now identified how hCII931-949 peptide from human CII binds to the HLA-DRB1*0405 allele by competitive pept

7、ide binding assay and crystal structure. The DRB1*0405 molecule was found to bind the hCII931-949 peptide but with dramatically reduced affinity to the well identified HLA-DRB1*0401 T cell epitope hCII259-273. The E266L amino acid substitution at P4 pocket of the hCII259-273 peptide increased the bi

8、nding affinity with HLA-DRB1*0405 molecule.The key residues that are important for HLA-DRB1*0405 binding were identified.Furthermore, we got the crystal structure of HLA-DRB1*0405 complexed with hCII931-949 peptide. The CII-specific, HLA-DRB1*0405 restricted T cell epitope identification might lay a

9、 scientific foundation for the RA vaccine development and clinical use.Keywords: Rheumatoid arthritis; MHCII; HLA-DRB1*0405; type II collagen (CII);5T cell epitope6目次1.91.1類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究意義91.2類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀111.2.1類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的遺傳因素111.2.2類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的自身抗原及其 T 細(xì)胞表位122.實(shí)驗(yàn)材料與方法142.1 實(shí)驗(yàn)材料142.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材142.1.2主要儀器152.2 實(shí)

10、驗(yàn)方法162.2.1 E.coli DH5化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備162.2.2 PCEP4-DRA1*0101 及 PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定162.2.3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 ExpiHEK293F 細(xì)胞以表達(dá) DRB1*0405-hCLIPmutd 蛋白162.2.4 DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白的純化172.2.5西方印跡法鑒定 DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白172.2.6 多肽競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)192.2.7 HLA-DRB1*0405-hCII931-949 復(fù)合物結(jié)晶及其晶體結(jié)構(gòu)解析202.2.8從 RA 病人全血中提取基因組 D

11、NA202.2.9 從 RA 病人抗凝血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC)212.2.10 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) (ELISA)222.2.11 統(tǒng)計(jì)處理和分析223.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析223.1表達(dá)質(zhì)粒獲得成功構(gòu)建223.2西方印跡法鑒定 HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白獲得成功表達(dá)243.3 對(duì)影響蛋白表達(dá)量的轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行餓優(yōu)化243.4多肽競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí) HLA-DRB1*0405 分子可特異性結(jié)合 hCII931-949 多肽243.5 P-2、P1、P4 和 P8 是 hCII931-949 多肽與 HLA-DRB1*0405 分子結(jié)合的主要位點(diǎn)2773.6HLA-DR

12、B1*0405 分子與 hCII931-949 多肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)283.7PBMC 體外刺激實(shí)驗(yàn)294.討論305.結(jié)論346.致謝357.參考文獻(xiàn)368.結(jié)尾398圖表清單1 102 203 (A-B) .234 245 246 (A-C) .266 (D) .277.288 299 309英文縮略詞對(duì)照表AlanineAAntigen presenting cellAPCCollagen-induced arthritisCIACollagen type IICIIEnzyme linked immunosorbent assayELISAGlycineGGlutamineQHemag

13、glutininHAHuman leukocyte antigenHLAMajor histocomplex class IIMHC IIOptical densityODPheripheral blood mononuclear cellPBMCPhenylalanineFRheumatoid arthritisRAProlinePShared epitopeSET cell receptorTCRTheronineT10結(jié)構(gòu)及功能性鑒定與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的二型膠原蛋白特異性、HLA-DRB1*0405 限制型 T 細(xì)胞表位1.引言1.1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究意義類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumat

14、oid arthritis, RA)是一種以慢性滑膜炎為主的自身免疫性疾病，主要影響腕部、手、膝蓋、踝和腳的小關(guān)節(jié)，然而在 15-25%的患者中也可能會(huì)影響到身體的其它器官，比如眼睛、皮膚、心臟、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)。截至 2016 年底，中國的 RA 患者總數(shù)高達(dá) 6000 萬。RA 發(fā)病率及致殘率都非常高，對(duì)人類健康造成非常嚴(yán)重的威脅，被稱為“不死的癌癥”。目前臨床上采用的藥物治療主要包括非甾類抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥（Disease-modifying anti-rheumatic drugs， DMARDs）、免疫抑制劑、生物制劑及植物藥等，治療的主要目的在于減輕關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，抑制病變發(fā)展及不

15、可逆骨質(zhì)破壞，盡可能保護(hù)關(guān)節(jié)和肌肉的功能，最終達(dá)到緩解病情或降低疾病活動(dòng)度的目標(biāo)。但是，眾多 RA 患者使用上述藥物幾年后常常會(huì)出現(xiàn)明顯的毒副作用以及耐藥性，使得多數(shù)患者的病情不能得到長期有效的控制。迄今為止，沒有一種藥物可以完全治愈 RA，因而發(fā)現(xiàn)新的治療性藥物是目前研究的重點(diǎn)。到目前為止，RA 的病因尚未完全明確，但研究發(fā)現(xiàn)該疾病與遺傳因素、微生物感染、激素刺激、吸煙、飲食等很多因素有關(guān)。由于 RA 是一種自身免疫性疾病，自身抗原的確定顯得尤為重要。人體內(nèi)存在多種關(guān)節(jié)特異性蛋白，例如：二型膠原蛋白（Collagen type II, CII）、人體軟骨糖蛋白（HCgp39）、瓜11氨酸化絲

16、聚蛋白和波形蛋白等等。目前 CII 被認(rèn)為是最有可能的自身抗原之一，因?yàn)樵摰鞍资墙M成透明軟骨的主要成分，組成該蛋白的賴氨酸和脯氨酸位點(diǎn)可被羥基化繼而糖基化，這種翻譯后修飾的蛋白可被機(jī)體視為外來抗原，從而誘導(dǎo)自身抗體的產(chǎn)生。相關(guān)研究顯示，在 RA 患者的血清和滑膜液中可檢測(cè)到 CII的抗體1。而在小鼠、大鼠和靈長類膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（Collagen-inducedarthritis, CIA）動(dòng)物模型中異源 CII 可誘發(fā) RA 疾病的產(chǎn)成，例如，雞來源的 CII可誘導(dǎo)恒河猴和普通狨猴產(chǎn)生類似 RA 的癥狀，而大鼠來源的 CII 可使小鼠產(chǎn)生類似 RA 的癥狀2，因此，CII 目前被認(rèn)為是最

17、主要的自身抗原之一。此外，在 RA 患者發(fā)炎的關(guān)節(jié)滑膜處存在大量活化的 CD4+ T 細(xì)胞，充分說明 T 細(xì)胞介導(dǎo)了該自身免疫性疾病的發(fā)生。其可能的機(jī)制是關(guān)節(jié)滑膜處的 CII 中某個(gè)翻譯后修飾肽段被抗原遞呈細(xì)胞（APC）細(xì)胞膜表面表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合物（MHC） II 分子識(shí)別，并被遞呈到 CD4+ T 細(xì)胞受體（TCR）繼而將 T 細(xì)胞活化（見圖 1）。在小鼠模型中，I-Aq 限制性 CII 主要抗原決定區(qū) CII263-271已被發(fā)現(xiàn)3，并且這個(gè)表位與 MHC II 和 T 細(xì)胞受體（T cell receptor, TCR）之間的結(jié)合也獲得了成功鑒定4。因此，作用于 RA 患者的 C

18、D4+ T 細(xì)胞的 CII主要抗原決定區(qū)的確定顯得至關(guān)重要。圖1. 抗原遞呈細(xì)胞（APC）與CD4+T細(xì)胞之間的相互作用。APC遞呈的MHC II分子與之結(jié)合的多肽復(fù)合物被CD4+ TCR識(shí)別，在共刺激分子的作用下將T細(xì)胞活化。12HLA-DRB1 共享表位區(qū)（Shared epitope, SE）是人們目前發(fā)現(xiàn)的與RA最密切相關(guān)的遺傳因素之一5。然而，這一共享表位區(qū)具有種族差異性：在歐洲RA患者中HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401 和HLA-DRB1*0404基因型所占比重較大，而在亞洲RA患者中（在中國、日本、韓國人群尤為顯著）約30-40%的患者攜帶HLA-DRB1*

19、0405等位基因6-8。在CIA模型和HLA-DRB1*0101，HLA-DRB1*0401 或HLA-DRB1*0404等位基因攜帶者的RA病人中間，自身反應(yīng)性T細(xì)胞能夠識(shí)別同一條CII260-273肽段3。位于264位點(diǎn)的賴氨酸（K264）能夠被羥基進(jìn)而糖基化。研究證實(shí)T細(xì)胞識(shí)別糖基化的CII多肽在關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生方面起到了非常重要的作用9。Balik等人研究表明在CIA動(dòng)物模型中，糖基化CII259-273/Aq 復(fù)合物有效抑制了關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生10 。該研究主要針對(duì)攜帶HLA-DRB1*0405 主導(dǎo)基因型的亞洲 RA 患者 ， 旨在確定 CII 特異性 ，HLA-DRB1*0405限制性T細(xì)胞

20、表位，該表位的確定將為RA疫苗的研發(fā)奠定科學(xué)基礎(chǔ)。1.2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的遺傳因素RA 是一種相對(duì)復(fù)雜的多因素導(dǎo)致的慢性自身免疫性疾病，環(huán)境因素比如高鈉攝入、吸煙或某些病菌或病毒感染均可以引起 RA 的發(fā)病，而遺傳因素占30%-50%11。位于第 6 號(hào)染色體短臂上的 21.31 區(qū)（6p21.31）的 HLA 復(fù)合體目前被認(rèn)為是與該疾病最為密切相關(guān)的遺傳因素之一。Stastny 于 1978 年首次證實(shí) HLA-DRB1*0401 基因與 RA 相關(guān) 12 ， 1986 年， Nepom 發(fā)現(xiàn)了HLA-DRB1*0404 基因也與 RA 存在著一定關(guān)聯(lián)性

21、13。目前研究表明與 RA 相13關(guān)的等位基因包括：HLA-DRB1*0101、*0102、*0401、*0404、*0405、*0408、*0409、*0410、*1001、*1402、*1406 和*1409 11，這些等位基因在 HLA-DR分子鏈位于 70-74 位點(diǎn)的第三超變區(qū)共同擁有一個(gè)相似的表位：QRRAA-*0101 、*0102 、*0404 、*0405 、*0408 、*0410 、*1402 、*1406 ；QKRAA-*0401 或者 RRRAA-*1001 5。這一共享表位區(qū)大大影響了與多肽的結(jié)合以及被 CD4+T 細(xì)胞的識(shí)別。而 HLA-DRB1*0402 (DE

22、RAA) 則被列為保護(hù)基因型14。相關(guān)研究證實(shí)該共享表位區(qū)在種族之間存在很大的差異：在歐洲RA 患者中，基因型為 HLA-DRB1*0101、*0401 和*0404 的比重較大8，然而在亞洲 RA 患者中，約 30-40%的患者攜帶 HLA-DRB1*0405 等位基因，該基因所占比重最大。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，HLA-DRB1*0405 基因尤其與韓國，日本和中國的 RA 患者密切相關(guān)。而全球大約有 11.9%的正常人群攜帶 HLA-DRB1*0405等位基因 15。因此，該項(xiàng)目研究的出發(fā)點(diǎn)是重點(diǎn)針對(duì) HLA-DRB1*0405 基因型陽性的 RA 患者設(shè)計(jì)個(gè)體化治療研究方案，其中 CII 特異性

23、，HLA-DRB1*0405限制型 T 細(xì)胞表位的鑒定是首要任務(wù)。1.2.2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的自身抗原及其 T 細(xì)胞表位RA認(rèn)為是由關(guān)節(jié)內(nèi)自身抗原引發(fā)的，人體內(nèi)存在多種關(guān)節(jié)特異性蛋白，例如： CII、蛋白聚糖、HCgp39、瓜氨酸化絲聚蛋白和波形蛋白等等。盡管經(jīng)過數(shù)年的研究，引發(fā)RA的自身抗原到目前為止尚未給出一個(gè)定論，然而在諸多自身抗原中，CII目前被認(rèn)為是引發(fā)RA的最潛在的自身抗原，因?yàn)镃II是構(gòu)成關(guān)節(jié)透明軟骨的主要蛋白，在3%-27%RA患者的血清中可檢測(cè)到CII的特異性抗體16，而且在最常用到的CIA動(dòng)物模型中用CII可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎。其中CII蛋白的翻譯后修飾在誘發(fā)炎癥過程中起到了

24、至關(guān)重要的作用。14RA患者發(fā)炎的軟骨組織和滑液中含有大量活化的CD4+ T細(xì)胞17，并且自身反應(yīng)性T細(xì)胞的數(shù)量與患者的病情呈現(xiàn)一定的關(guān)聯(lián)性18?，F(xiàn)在研究明確的是在Aq和DR4轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，位于CII 264和270位點(diǎn)的兩個(gè)賴氨酸可羥基化繼而糖基化，這一修飾可被T細(xì)胞識(shí)別，從而誘發(fā)CIA或者對(duì)自身CII產(chǎn)生免疫耐受19, 20。目前研究最多的HLA-DRB1*0401分子與RA相關(guān)的T細(xì)胞表位為CII 261-273, 并且二者之間的親和力以IC50表示為180nM21。另有文獻(xiàn)報(bào)道在HLA-DRB1*0401和*0101轉(zhuǎn)基因CIA動(dòng)物模型中自身反應(yīng)性T細(xì)胞能夠識(shí)別CII蛋白259-2

25、73段表位22，這段表位與Aq相結(jié)合。T細(xì)胞可以特異性識(shí)別這段翻譯后修飾表位的現(xiàn)象同樣存在于基因型為DR4的RA患者中17，這一發(fā)現(xiàn)表明針對(duì)表位的特異性治療可能會(huì)給RA患者帶來光明。然而種族差異，不同的種族攜帶不同的 HLA-DRB1 分子，不同的HLA-DRB1 分子結(jié)合的 T 細(xì)胞表位也會(huì)存在一些差異。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，可以結(jié) 合 HLA-DRB1*0405 分 子 的 多 肽 包 括 CII 256-271 ：GEPGIAGFKGEQGPKG23、CII 429-442: GGVGPIGPPGERGA、 CII 593-610:SGFQGLPGPPGPPGEGGKP、和CII1064-10

26、81:RGFTGLQGLPGPPGPSGD24，然而只有CII 1064-1081 這條多肽能夠刺激67%的攜帶HLA-DRB1*0405 等位基因的 RA 患者的PBMC 產(chǎn)生IL-2 和IFN-25,說明 CII 1064-1081 是 HLA-DRB1*0405 分子最有可能的 T 細(xì)胞表位?；诖隧?xiàng)研究，我們根據(jù) CII 的三螺旋結(jié)構(gòu)重新命名多肽 hCII931-949，公司合成并通過一系列多肽競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)和晶體結(jié)構(gòu)首次從結(jié)構(gòu)和功能上鑒定了 CII 來源的HLA-DRB1*0405 分子限制型的 T 細(xì)胞表位。152.實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1 實(shí)驗(yàn)材料2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材hCII93

27、1-949(GHRGFTGLQGLPGPPGPSG);hCII931-945(GHRGFTGLQGLPGPP) 及其被丙氨酸逐一位點(diǎn)替換的多肽; hCII259-273(GIAGFKGEQGPKGEP);hCII259-273_P4E266L(GIAGFKGLQGPKGEP);HA306-318 (PKYVKQNTLKLAT) 以及生物素標(biāo)記的 hCLIP (Biotin-Ahx-hCLIP:Biotin-Ahx-KPVSKMRMATPLLMQA) 多肽均由 Biomatilk 公司合成，每條多肽的純度都在 95% 以上。 HLA-DRA*0101, HLA-DRB1*0405-hCLIPmu

28、t 和HLA-DRB1*0405-hCII931-949 序列由德國 Eurofins Genomics 公司合成。 質(zhì)粒小提, 大提試劑盒和 QIAamp DNA blood Midi Kit 均購自 QIAGEN 公司。10,000X Gelred nucleic acid gel stain 購自 Biotium 公司。Expi293FTM 細(xì)胞, Expi293 蛋白表達(dá)培養(yǎng)基，Opti-MEM，RPMI 1640 培養(yǎng)基，L-Glutamine, 重組 human IL-2蛋白，羧芐青霉素，青霉素-鏈霉素，Nu12% Bis-Tris 蛋白分離膠和 IFNgamma human un

29、coated ELISA kit 均購自 Thermo fisher scientific 公司。FectoPROTM 轉(zhuǎn)染試劑購自 Polyplus 公司。組氨酸標(biāo)簽鎳柱親和層析柱，HiLoad16/60 Superdex 200 pg凝膠過濾預(yù)裝柱, Vivaspin 20 30kDa 蛋白濃縮管,Amersham hyperfilm ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒和 Ficoll-paqueTM plus 均購自 GEHealthcare 公司。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP) 標(biāo)記的山羊抗鼠二抗購自 SouthernBiotech 公司。DELFIA Eu

30、-N1 Streptavidin 購自 Perkin Elmer公司。5ml, 10ml 和 25ml 吸管均購自 Sarstedt 公司。HPLC 級(jí)純水購自山海默恩化學(xué)科技有限公司。ELISA Costar 3590 酶標(biāo)板購自 VWR 公司。16主要儀器冰箱 BCD-215KAV DZHaier冰箱 BCD-573WY-C Ranshen-80超低溫冰箱88000 Thermo Fisher Scientific磁力攪拌器 GL-3250C Kylin-Bell Lab Insruments抗體孵育搖床 TSC-8 Qiliv BEI ERYIQIZHI水平搖床 TS-1 Qiliv B

31、EI ERYIQIZHI電泳儀 BG-Power6000 BAYGENE蛋白電泳槽 Mini-protean Tetra Bio-RADDNA 電泳槽 Wide Mini-Sub cell GT Bio-RAD臺(tái)式離心機(jī) 5810R Eppendorf落地式高速離心機(jī) Avanti J-E BECKMAN COULTER金屬浴鍋 BYQ6044E-216 BIOER TECHNOLOGYCO CTD加熱恒溫水浴鍋 HWS12/HWS28 上海一恒科技公司渦旋振蕩器 Mixer V6 ESSENSCIEN手掌離心機(jī) XK-400 珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) ChemiDo

32、c touch 美國 BiotekG1000 基因擴(kuò)增儀 TC-96/G/H（b)B 杭州博日科技PH 測(cè)量儀 S210 梅特勒-拖利多儀器（上海）有限公司分析天平 220g ME203E METTLER TOLEDO37 CO2 培養(yǎng)箱HF90/HF 240 Thermo Fisher Scientific恒溫?fù)u箱 ZWY-211C ZHCHENE制冰機(jī) XB-130-FZ/R134A GRANT烤箱 HH-811-500 上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械廠17倒置顯微鏡 CKX31 Olympus酶標(biāo)熒光多功能檢測(cè)儀 Synergy H1 美國 BiotekAKTApure 蛋白純化儀 GE healt

33、hcare2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 E.coli DH5化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備取一管商品化的E.coli DH5化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,在制備好的LB 固體培養(yǎng)平板上劃線，將平板置于 37孵育一晚以獲得單克隆。挑取單克隆到 5ml LB 液體培養(yǎng)基，置于 37搖床培養(yǎng)一晚。第二天，接種 2ml 培養(yǎng)過夜的細(xì)菌培養(yǎng)液到200ml 新鮮的 LB 液體培養(yǎng)基，置于 37 度搖床繼續(xù)培養(yǎng)至 OD600=0.4。將細(xì)菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至 500ml 離心瓶于 3000g, 4離心 15 分鐘。棄掉上清，加入 20ml0.1M CaCl2 重懸，冰浴 30 分鐘后于 3000g, 4離心 10 分鐘。加入 4ml 含有

34、 15%甘油的 0.1M CaCl2 重懸細(xì)胞，分裝細(xì)胞然后置于-80低溫保存。2.2.2 PCEP4-DRA1*0101 及PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut 質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定HLA-DRA1*0101 和 HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 基因序列送公司合成后，酶切并連接到 PCEP4 表達(dá)載體，以熱休克的方法轉(zhuǎn)化到 DH5化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，37培養(yǎng) 1 小時(shí)，取菌液涂板。第二天，從 LB 平板中挑取單克隆，37培養(yǎng)過夜后抽提質(zhì)粒，然后通過雙酶切和測(cè)序的方法共同鑒定質(zhì)粒序列的準(zhǔn)確性。2.2.3 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 ExpiHEK293F 細(xì)胞以表達(dá) DRB1*0405-h

35、CLIPmut 蛋白轉(zhuǎn)染前一天準(zhǔn)備 ExpiHEK293F 細(xì)胞，濃度調(diào)整為 1x106/ml 后放置 37二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱懸浮培養(yǎng)。 24 小時(shí)后，在一個(gè)含有 Opti-MEM 培養(yǎng)液的試管中加入 FectoPRO 轉(zhuǎn)染試劑，漩渦混勻。在另一個(gè)含有 Opti-MEM 培養(yǎng)液的18試管中按一定比例加入 PCEP4-DRA1*0101 及 PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut 質(zhì)粒并漩渦混勻。然后把兩個(gè)試管的液體混合并漩渦混勻，室溫靜置 15 分鐘后，把混合物逐滴加入 ExpiHEK293F 細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞放到 37二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。2.2.4 DR

36、B1*0405-hCLIPmut 蛋白的純化轉(zhuǎn)染 5-6 天后，待細(xì)胞的存活率為 80%左右終止細(xì)胞培養(yǎng)，離心細(xì)胞培養(yǎng)液后收取上清，通過 0.45 m 的濾膜過濾，DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白經(jīng)KTA純化系統(tǒng)（鎳離子親和層析和尺寸排阻色譜法）純化。首先用含有 50 mMTris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazole 的平衡液平衡 His-Trap Excel 柱子，然后上樣，最后用含有 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 500 mM Imidazole 的洗脫液洗脫蛋白，洗脫下來的蛋白經(jīng)過 10KD Amicon Ultra

37、centrifugal filter units濃縮后再經(jīng) HiLoad Superdex 200 pg 純化柱去除蛋白聚集體。純化后的蛋白可用一抗 Mouse anti-DR 和二抗 anti-mouse-HRP 經(jīng)下述西方印跡法鑒定。2.2.5 西方印跡法鑒定 DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白（1）常用緩沖液及其配制 30丙烯酰胺溶液丙烯酰胺29 g甲叉丙烯酰胺1 g蒸餾水100 ml攪拌器攪拌溶解，待完全溶解后，過濾，4避光儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?2上樣緩沖液(pH6.8)62.5 mM Tris-HCl pH 6.8，2% w/v SDS，10% 甘油，50 mM -巰基乙醇，0.01%

38、 w/v 溴酚蘭。取 1 M 的 Tris-HCl (pH 6.8) 0.625 ml，SDS 0.2 g，甘油 1 ml，19-巰基乙醇 0.5 ml，溴酚蘭 0.001 g，用水補(bǔ)加至 5 ml。 Tris-甘氨酸電泳緩沖液25 mM Tris 堿，250 mM 甘氨酸，0.1% w/v SDS?？膳涑?10的儲(chǔ)存液，900 ml ddH2O 中溶解 30.2 g Tris 堿和 188 g 甘氨酸，然后加入 100 ml w/v 10% SDS，用 ddH2O 補(bǔ)至 1000 ml。電轉(zhuǎn)移緩沖液25 mmol/L Tris 堿，0.2 mmol/L 甘氨酸，0.037% w/v SDS，

39、20%甲醇(pH 8.5)?？膳涑?10儲(chǔ)液，900 ml ddH2O 中溶解 58 g Tris 堿，29 g 甘氨酸和 3.7 g SDS，ddH2O 補(bǔ)足至 800 ml。用時(shí)取 80 mL 10儲(chǔ)液用 ddH2O 稀釋至 800ml，加入200ml 甲醇，4預(yù)冷備用。 10Tris-鹽緩沖液(TBS)g Tris 堿，80 g NaCl，加入 800 ml 去離子水，用稀 HCl 調(diào) pH 至 7.6，ddH2O 至總量 1000 ml。使用時(shí)，稀釋成 1TBS 溶液，加入 0.1%的 Tween-20，即成 TBST 洗滌液。封閉液1TBS 含 0.1% Tween-20 和 5%

40、w/v 脫脂奶粉，攪拌溶解?？贵w稀釋液1TBS 含 0.1% Tween-20 和 5% w/v 脫脂奶粉，攪拌溶解。（2）免疫印跡操作步驟制備好的樣品經(jīng)比色法測(cè)定蛋白濃度，加樣，進(jìn)行 4-12%的 SDS凝膠電泳 1.5-2 小時(shí) (恒流，16 mA/gel)，保證所加樣品蛋白總量一致。將 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白用 Bio-Rad 微型電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，于冰上轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(電轉(zhuǎn)移時(shí)間和電壓因檢測(cè)蛋白分子量而定)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將硝酸纖維素膜置于平緩搖動(dòng)的搖床上，以 20 ml 封閉緩沖液室溫下封閉 1 小時(shí)或 4封閉過夜。20 5 ml TBST 洗膜 5 次，每次 3 分鐘。

41、一抗 Mouse anti-DR L243 單克隆抗體用抗體稀釋液 2000 倍稀釋，在搖床上室溫孵育 1 小時(shí)，確?？贵w稀釋液能完全覆蓋膜。 用 25 ml TBST 洗膜 5 次，每次 3 分鐘。HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠二抗用抗體稀釋液 30000 倍稀釋，在搖床上室溫孵育 1小時(shí)，確?？贵w稀釋液能完全覆蓋膜。 25 ml TBST 振蕩洗膜 5 次，每次 3 分鐘。膜稍瀝干后加入化學(xué)發(fā)光試劑(125 l/cm2，用前 30 分鐘將 A、B 液混合)室溫孵育 1 分鐘左右，迅速用保鮮膜包好后置于暗盒內(nèi)與 X 膠片貼在一起進(jìn)行曝光，曝光時(shí)間依發(fā)光信號(hào)強(qiáng)弱而定，10 秒到 10 分鐘左右。X 膠

42、片經(jīng)顯影、定影后晾干，圖片掃描后保存。2.2.6 多肽競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)先將多肽在含有蛋白酶抑制劑的 PBS 中由高濃度到低濃度依次 2 倍稀釋，50l/孔由排槍加到 non-binding 的 96 孔板，然后在上述緩沖液中加入適量的DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白和 Biotin-Ahx-hCLIP 多肽，其終濃度分別為 0.1 M和 3 M, 混勻后以 50l/孔逐孔加到同一 96 孔板中，稍稍震蕩混勻并離心，室溫作用 48 小時(shí)。以 L243 抗體提前一天鋪 ELISA 板，PBST 清洗后將上述 96孔板中的混合液轉(zhuǎn)移至 ELISA 板中，37孵育 1 小時(shí)，PBST 洗四次，加

43、入 2000倍稀釋的 Eu-Streptavidin, 37孵育 1 小時(shí)洗板，最后加入 Enhancement 溶液，室溫作用 5 分鐘后讀板。212.多肽競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)圖解HLA-DRB1*0405-hCII Pep.復(fù)合物結(jié)晶及晶體結(jié)構(gòu)解析利用坐滴蒸汽擴(kuò)散法獲得 HLA-DRB1*0405-hCII931-949 蛋白復(fù)合物晶體，拿到晶體之后進(jìn)行 X 射線衍射，收集衍射圖譜，通過計(jì)算，進(jìn)一步得到該蛋白復(fù)合物的原子結(jié)構(gòu)。2.2.8 從 RA 病人全血中提取基因組 DNAA、試劑準(zhǔn)備：加入 4.4 ml ddH2O 到裝有 QIAGEN 蛋白酶的小瓶中，待其溶解后分裝，置于-20冰箱保存。在

44、AW1 和 AW2 緩沖液中按瓶上說明加入適量的96-100%乙醇，輕輕混勻。B、取 15ml 離心管，每管底部加入 100 l QIAGEN 蛋白酶,然后加入 1ml 全血，22輕輕混勻。C、加入 1.2ml AL 緩沖液，蓋上蓋子，上下翻轉(zhuǎn)離心管 15 次，然后渦旋震蕩 1分鐘以充分混勻，然后置于 70水浴 10 分鐘。D、加入 1ml 96-100%乙醇到混合液，上下翻轉(zhuǎn)離心管 10 次，然后渦旋震蕩以充分混勻。E、將所有混合液輕輕轉(zhuǎn)移到試劑盒提供的 QIAamp Midi 柱式離心管，3000 rpm離心 3 分鐘。F、棄掉過濾液，加入 2ml AW1 緩沖液，5000 rpm 離心

45、1 分鐘。G、加入 2ml AW2 緩沖液，5000 rpm 離心 15 分鐘。H、將 QIAamp Midi 柱置于一個(gè)干凈的 15 ml 離心管上，加入 200 l ddH2O, 室溫靜置 5 分鐘，5000 rpm 離心 2 分鐘。I、提取的基因組 DNA 取 2 l 通過 Nanodrop 測(cè)濃度，取適量送北京旌準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司做HLA-DRB1 基因型鑒定，剩余的DNA樣品置于-20冰箱凍存。2.2.9 從 RA 病人全血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）A、用 10ml EDTA 抗凝管收集 HLA-DRB1*0405 等位基因陽性的 RA 病人靜脈血。B、取 8 ml 血液到

46、50ml 離心管，以等量 PBS 稀釋。C、另取 50 ml 離心管，在管底輕輕注入 20ml Ficoll, 將稀釋好的血液輕輕鋪在Ficoll 上。D、離心機(jī)升速和降速設(shè)置為 0，20，400g 離心 30 分鐘。E、用移液槍輕輕吸出 PBMC 層到一個(gè)新的 50 ml 離心管中，加入 30 ml PBS,400g 離心 10 分鐘。F、棄上清，2 ml 完全 RPMI 培養(yǎng)基重懸 PBMC, 細(xì)胞計(jì)數(shù)。按 1x106 個(gè)細(xì)胞/孔鋪到 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入 20 g/ml 多肽刺激，同時(shí)加入人來源的 IL-223細(xì)胞因子，將 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于 37 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng) 7

47、天。2.2.10 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）A、待 PBMC 培養(yǎng)到第 6 天，用抗人 IFN-gamma 的抗體鋪酶標(biāo)板，100 l/孔，4過夜。B、第二天，PBST 洗板五次，室溫封閉 1h。C、PBST 清洗五次，加入標(biāo)準(zhǔn)液與培養(yǎng)第 7 天的細(xì)胞培養(yǎng)上清，100 l/孔，4過夜。D、清洗五次，加入生物素標(biāo)記的抗人 IFN-gamma 抗體，100 l/孔，室溫孵育1 小時(shí)。E、清洗五次，加入 100 l/孔 Avdin-HRP,室溫孵育 30 分鐘。F、清洗五次，加入 100 l/孔 1XTMB 溶液，室溫孵育 15 分鐘。G、待標(biāo)準(zhǔn)品孔出現(xiàn)明顯階梯狀藍(lán)色之后加入 50 l 終止液。

48、K、10 分鐘之內(nèi) 450nm 檢測(cè) OD 值。L、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度。2.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析所有都實(shí)驗(yàn)都經(jīng)過三次以上重復(fù)和證實(shí)。用 Graphpad Prism 5 軟件作圖，數(shù)據(jù)用均值 標(biāo)準(zhǔn)差 (x SD)表示。單因素方差分析用 unpaired t-test 方法；雙因素方差分析用 Two-way ANOVA 方法。*p 0.05，*p 0.01，*p 0.001表明組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1 表達(dá)質(zhì)粒獲得成功構(gòu)建如圖 3A, His-tag 為純化蛋白用，F(xiàn)os/Jun 序列的加入能夠保證和鏈形成24二聚體，TEV 酶切位點(diǎn)的加入是為了后續(xù)切割蛋白做結(jié)

49、晶用。hCLPmut 的存在有助于維持1 和1 之間形成的 Pocket 的空間構(gòu)象。Thrombin 酶切位點(diǎn)的加入是為了后續(xù)其它多肽的替換。圖 3B 為 HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白的空間結(jié)構(gòu)示意圖。(A)(B)圖 3. (A) 和鏈表達(dá)序列示意圖。(B) HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 及其嵌合的多肽組成的蛋白復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)示意圖。253.2 西方印跡法鑒定 HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白獲得成功表達(dá)圖 4.西方印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)。條帶 1：HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白；條帶 2：HLA-DRB1*0401-

50、hCLIPmut 蛋白(陽性對(duì)照)；3：BSA(陰性對(duì)照)。一抗: Mouse Anti-DR L243 單抗，2000 倍稀釋，二抗: Anti-mouse IgG-HRP，30000 倍稀釋。3.3 對(duì)影響蛋白表達(dá)量的轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行了優(yōu)化由于 HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白表達(dá)需要 和 鏈共轉(zhuǎn)染ExpiHEK293F 細(xì)胞，不同的轉(zhuǎn)染比率會(huì)直接影響蛋白的表達(dá)量。我們做了幾個(gè)不同比率的比較，結(jié)果如圖 5 所示，和鏈比率在 3:2 時(shí)，蛋白的表達(dá)量最高，約 8.4mg/L。圖 5. 蛋白表達(dá)量在不同轉(zhuǎn)染條件下的比較。和鏈轉(zhuǎn)染比率分別在 1：1；2：3；1：2 和 3：2 條件

51、下 HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白的表達(dá)量，*p 0.01。263.4 多肽競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí) HLA-DRB1*0405 蛋白分子可特異性結(jié)合 hCII931-949 多肽多肽競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)用來自流感病毒表面表達(dá)的血凝素蛋白（Hemagglutinin）的 HA306-318 多肽作為陽性對(duì)照，因?yàn)樵摱嚯囊呀?jīng)被證實(shí)為與 HLA-DRB1*04分子結(jié)合力很強(qiáng)的主要抗原表位。如圖 6A 所示，HLA-DRB1*0405 和HLA-DRB1*0401 分子與 HA308-316 之間具有相似的結(jié)合力， hCII259-273 多肽與 HLA-DRB1*0401 分子具有很強(qiáng)的結(jié)合力

52、（ IC50=26 M ）， 與HLA-DRB1*0405 分子卻不結(jié)合。而圖6B 顯示, hCII931-949 與HLA-DRB1*0401分子之間的結(jié)合力非常弱（IC50=5223 M）, 與 HLA-DRB1*0405 分子卻具有很強(qiáng)的結(jié)合力（IC50=32 M）。該實(shí)驗(yàn)證實(shí) hCII 931-949 可特異性結(jié)合HLA-DRB1*0405 分子。如圖 6C，hCII259-273 與 hCII931-949 多肽序列的比對(duì)顯示 P1、P6 和 P9 的殘基位點(diǎn)都相同，而 P4 殘基位點(diǎn)不同。將 hCII259-273 多肽中 P4 處的殘基谷氨酸（Glutamic acid，E）被亮

53、氨酸(Leucine，L)置換后用多肽競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)（圖 6D）檢測(cè)發(fā)現(xiàn) hCII259-273_P4E266L 與 HLA-DRB1*0401之間的結(jié)合力（IC50=187 M）相比 hCII259-273 與 HLA-DRB1*0401 之間的結(jié)合力（IC50=26 M）大幅度降低，而 hCII259-273_P4E266L 與 HLA-DRB1*0405分子之間的結(jié)合力相比 hCII259-273_P4E266L 與 HLA-DRB1*0405 分子間的結(jié)合力（IC50=9 M）大幅度增強(qiáng)。27(A)(B)(C)28(D)圖 6. 多肽競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)及多肽序列比對(duì)。 (A) HLA-DRB1

54、*0401 與HLA-DRB1*0405 分子與hCII259-273 多肽的結(jié)合，HA306-318 用來做陽性對(duì)照。(A) HLA-DRB1*0401 與 HLA-DRB1*0405 分子與 hCII931-949 多肽的結(jié)合，HA306-318 用來做陽性對(duì)照。(C) hCII259-273 與 hCII931-949 多肽的序列比對(duì)。HLA-DRB1*0401和 HLA-DRB1*0405 分 子 與 hCII259-273 和hCII259-273_P4E266L 多肽的結(jié)合。3.5 P-2、P1、P4 和 P8 是 hCII931-949 多肽與 HLA-DRB1*0405 分子結(jié)

55、合的主要位點(diǎn)為了明確 hCII931-949 多肽與 HLA-DRB1*0405 分子結(jié)合的主要位點(diǎn)，我們讓公司合成了一系列由丙氨酸（Alanine, A）替換的多肽類似物用來做多肽競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)。如圖 7 所示，丙氨酸在 P-2 精氨酸（Argnine，R）、P1 苯丙氨酸（Phenylalanine，F(xiàn)）、 P4 亮氨酸（Leucine，L）和 P9 甘氨酸（Glycine，G）位點(diǎn)的替換顯著降低了與 HLA-DRB1*0405 分子的結(jié)合，相反的，脯氨酸29（Proline, P）P8 位點(diǎn)的替換大大增強(qiáng)了 hCII931-949 多肽與 HLA-DRB1*0405分子間的結(jié)合，而其它位點(diǎn)

56、的氨基酸替換并未引起顯著的改變。該實(shí)驗(yàn)說明P-2、P1、 P4、P8 和 P9 是影響 hCII931-949 多肽與 HLA-DRB1*0405 分子結(jié)合的主要位點(diǎn)。圖 7. 由丙氨酸替換的多肽類似物與 HLA-DRB1*0405 分子的競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)。丙氨酸在 P-2 、P1 、 P4 和 P9 位點(diǎn)的替換顯著降低了 hCII931-949 多肽與HLA-DRB1*0405 分子的結(jié)合；在 P8 位點(diǎn)的替換顯著增強(qiáng)了 hCII931-949 多肽與 HLA-DRB1*0405 分子的結(jié)合；其它位點(diǎn)的替換未引起結(jié)合力的改變。數(shù)據(jù)表示為平均值 SD， , p 0.05;, p 0.01；, p

57、0.001。3.6 HLA-DRB1*0405 分子與 hCII931-949 多肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)如圖 8 所示，HLA-DRB1*0405 分子與 hCII931-949 多肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)揭示了 hCII931-949 多肽 P1、 P4、P6 和 P9 的錨定位點(diǎn)：P1 是位于 935 位點(diǎn)30的苯丙氨酸（Phenylalanine，F(xiàn)），P4 是位于 938 位點(diǎn)的亮氨酸，P6 和 P9 是分別位于 940 和 943 的甘氨酸（Glycine, G）。從 TCR 的角度看，hCII931-949 多肽的側(cè)鏈位于 936 位點(diǎn)的 P2-蘇氨酸（Threonine，T）,位于 939

58、 位點(diǎn)的 P5-谷氨酰胺（Glutamine，Q）和位于 942 位點(diǎn)的脯氨酸（Proline, P）都朝向口袋凹槽的外側(cè)，共同形成了一個(gè)與 TCR 結(jié)合的極性不帶電的界面。圖 8. HLA-DRB1*0405 分子與 hCII931-949 多肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。位于 P1、P4、P6 和 P9 的苯丙氨酸、亮氨酸和甘氨酸很好的嵌合到 HLA-DRB1*0405 分子的凹槽內(nèi)；位于 P2、P5 和 P8 的蘇氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸統(tǒng)一朝向凹槽外側(cè)，共同形成了一個(gè)與 TCR 作用的界面。3.7 PBMC 體外刺激實(shí)驗(yàn)我們從廣州珠江醫(yī)院風(fēng)濕科收集了 27 例 RA 患者的全血樣品（1ml/患者）

59、，如 2.2.8 所述，從 1ml 全血中提取基因組 DNA 后送公司測(cè)序以篩選HLA-DRB1*0405 等位基因陽性的 RA 患者。測(cè)序結(jié)果顯示 9 位 RA 患者攜帶HLA-DRB1*0405 等位基因，其中有四位陽性患者和一位陰性患者愿意無償為我們提供 10ml 血液樣品。我們從采集的抗凝血中提取 PBMC，通過多肽體外31刺激實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)攜帶 HLA-DRB1*0405 等位基因的三位患者 RA1、RA2 和 RA3都能被 HA306-318 多肽刺激產(chǎn)生 IFN-gamma。未攜帶 HLA-DRB1*0405 等位基因型的 RA 患者 RA4 和健康對(duì)照（Healthy control

60、，HC）對(duì)所加多肽沒有任何反應(yīng)。RA1 和 RA3 患者對(duì) hCII931-949 和 hCII931-945_P8HyP 均沒有反應(yīng)，而RA2 患者的 PBMC 能夠被 hCII931-945_P8HyP 多肽刺激產(chǎn)生 IFN-gamma。圖 9. PBMC 體外刺激實(shí)驗(yàn)。PBMC 被提取出來之后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按 1x106 個(gè)細(xì)胞/孔鋪到 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入 20 g/ml 多肽刺激，同時(shí)加入人來源的 IL-2細(xì)胞因子，將 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于 37 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第 7 天，收集上清檢測(cè) IFN-gamma 的含量。數(shù)據(jù)表示為平均值 SD， , p 0.05; , p