實(shí)驗(yàn)2-液相色譜法

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)專心-專注-專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)儀器分析實(shí)驗(yàn)講義02實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)化學(xué)樓315實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)3授課教師實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目高效液相色譜法測(cè)定蘆丁片中蘆丁含量預(yù)習(xí)提要1. 液相色譜分離原理；2. 液相色譜分類；3. 液相色譜定量分析方法；4. 高效液相色譜儀基本構(gòu)造及特點(diǎn)；5. 反相色譜與正相色譜；6. 內(nèi)標(biāo)法原理及應(yīng)用范圍;7. 高效液相色譜儀操作基本步驟。實(shí)驗(yàn)報(bào)告部分一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求1. 了解高效液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)及基本操作；2. 了解反相色譜法的基本規(guī)律；3. 掌握利用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行色譜定量分析的實(shí)驗(yàn)方法 。二、實(shí)驗(yàn)原理

2、1. 液相色譜法：在液相柱色譜中，采用顆粒十分細(xì)的高效固定相，并采用高壓泵輸送流動(dòng)相，全部工作通過儀器來完成。這種色譜法稱為高效液相色譜法。主要分為四類，即液固吸附色譜、液液分配色譜、離子交換色譜和分子排阻色譜。 其中液液分配色譜是根據(jù)不同組分在兩種互不相溶的液相中的分配系數(shù)不同而實(shí)現(xiàn)分離的，流動(dòng)相的極性小于固定相的化學(xué)鍵合相色譜稱為正相色譜，流動(dòng)相的極性大于固定相的化學(xué)鍵合相色譜稱為反相色譜。反相色譜是目前最常用的液相色譜分離方法。如以C18烷基鍵合相柱，采用甲醇或乙氰的水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分析。2. 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法（外標(biāo)法）：3. 液相色譜儀基本構(gòu)造(同學(xué)自行完成)三、儀器與試劑1. 儀

3、器：液相色譜儀、微量注射器、色譜柱(C18柱250 mm4.6 mm)、紫外檢測(cè)器(254nm)、超聲波脫氣機(jī)、抽濾裝置一套2. 試劑：甲醇(色譜純)、超純水、蘆丁(對(duì)照品)、復(fù)方蘆丁片四、HPLC基本操作(一) 準(zhǔn)備工作1. 流動(dòng)相處理：(1) 流動(dòng)相用真空泵抽濾：有機(jī)溶劑用有機(jī)膜過濾，水相用水膜或有機(jī)膜過濾。過濾時(shí)瓶子潤(rùn)洗，膜潤(rùn)濕。水過濾2遍，有機(jī)相過濾1遍。(2) 過濾后裝入流動(dòng)相瓶中。2. 開機(jī)與聯(lián)機(jī)： 開計(jì)算機(jī)開液相機(jī)器各個(gè)模塊電源（從上到下或從下到上均可）（本次實(shí)驗(yàn)開從上到下4個(gè)模塊：脫氣裝置，四元泵，柱溫控制器，DAD檢測(cè)器）開機(jī)后，計(jì)算機(jī)顯示屏右下角顯示“本地連接” 桌面HPL

4、C聯(lián)機(jī)(二) 沖洗系統(tǒng)（此時(shí)應(yīng)關(guān)閉紫外氘燈）(1) 打開沖洗閥（逆時(shí)針旋松即可，不可多旋，否則會(huì)漏液）；(2) A,B,C,D四個(gè)通道全放入水相溶劑瓶，單擊泵圖標(biāo)，設(shè)置流速5ml/min，比例均為25%，確定，沖洗15min;(3) 然后將A,B,C,D四個(gè)通道全放入甲醇溶劑瓶，單擊泵圖標(biāo)，設(shè)置流速5ml/min，比例均為25%，確定，沖洗15min;(4) 設(shè)置泵流速為0ml/min，結(jié)束沖洗。(三) 流動(dòng)相脫氣除去流動(dòng)相中的氣泡 (1) 打開沖洗閥; (2) 設(shè)置泵參數(shù)：流速5ml/min.依次設(shè)置A/B/C/D的比例為100%，先水后鹽再水后有機(jī)溶劑。每個(gè)通道，即每種流動(dòng)相脫氣5min;

5、 (3) 關(guān)閉沖洗閥(脫氣過程氘燈關(guān)閉)。(四) 平衡色譜柱紫外燈開 (1) 90%甲醇：10%水相沖洗30min，流速1ml/min (2) 用測(cè)試樣品條件的流動(dòng)相沖洗柱子約30min，流速1ml/min，至色譜基線基本趨于平穩(wěn)，大約正負(fù)0.2范圍波動(dòng)，即可結(jié)束平衡柱操作。若基線波動(dòng)大，可點(diǎn)擊平衡按鈕調(diào)整。(五) 進(jìn)樣方法設(shè)置脫機(jī)模式中操作 (1) 建立方法脫機(jī)：桌面HPLC脫機(jī)，“方法”“新建方法” (2) 泵參數(shù)設(shè)定：流速設(shè)為實(shí)驗(yàn)條件值。0.81ml/min，A/B/C/D通道比例設(shè)為實(shí)驗(yàn)條件值 (3) 柱溫箱參數(shù)設(shè)定：柱溫 (4) 檢測(cè)器參數(shù)設(shè)定：波長(zhǎng)、帶寬、峰寬等 (5) “運(yùn)行時(shí)選

6、項(xiàng)表”“數(shù)據(jù)采集” (6) “方法”“方法另存為”名稱，保存 (7) 進(jìn)樣前調(diào)用該方法即可 (六) 進(jìn)樣聯(lián)機(jī)模式中操作 (1) 進(jìn)樣前，新建一個(gè)文件夾，以日期+名字或樣品命名 (2) 視圖菜單首選項(xiàng)，設(shè)定新建文件夾為數(shù)據(jù)路徑，以保存數(shù)據(jù) (3) ”運(yùn)行控制”“樣品信息”，添加樣品信息，樣品位置，文件名，保存路徑 (七) 關(guān)機(jī) (1) 所有樣品測(cè)試完后，要將流動(dòng)相沖出來，調(diào)用沖柱子的方法，沖洗30min。再用100甲醇沖洗柱子，流速為1ml/min. (2) 退出色譜工作站，關(guān)閉計(jì)算機(jī) (3) 依次（從下到上）關(guān)閉色譜儀各個(gè)模塊電源 五、實(shí)驗(yàn)步驟1. 準(zhǔn)備工作 (1)流動(dòng)相過濾; (2) 沖洗柱

7、子; (3) 流動(dòng)相脫氣; (4) 平衡柱子2. 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20 mg , 置100 mL 棕色容量瓶中, 加甲醇適量, 超聲溶解, 用流動(dòng)相稀釋至刻度, 搖勻,作為對(duì)照品溶液, 經(jīng)0.45 m 濾膜過濾后備用。3. 供試品溶液的制備取復(fù)方蘆丁片樣品10 片, 研細(xì), 精密稱取適量(約相當(dāng)于蘆丁25 mg),各取3 份, 分別置于50 mL 棕色容量瓶中, 加甲醇適量, 超聲溶解, 用流動(dòng)相稀釋至刻度, 搖勻,經(jīng)0.45 m 濾膜過濾。精密量取續(xù)濾液2.5 mL ,置50 mL 容量瓶中, 用流動(dòng)相稀釋至刻度后, 搖勻, 即得供試品溶液。4. 色譜分析條件

8、 色譜柱 18 柱， 流動(dòng)相V (甲醇)V(0.1 % 冰醋酸)= 6040 , 檢測(cè)波長(zhǎng)362 nm , 流速0.8 mLmin-1 , 柱溫35 , 進(jìn)樣量20 L , 外標(biāo)法計(jì)算含量5. 分析項(xiàng)目(1) 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及其線性關(guān)系 精密量取一定量蘆丁對(duì)照品溶液, 用流動(dòng)相稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為12.500 , 25.000 , 50.000 ,100.000 , 150.000 , 200.000 gmL-1的系列對(duì)照品溶液, 依次進(jìn)樣并平行測(cè)定3 次, 采用最小二乘法以蘆丁質(zhì)量濃度(Y )對(duì)峰面積(X)作圖, 并進(jìn)行線性回歸,計(jì)算相關(guān)系數(shù)R；(2) 精密度試驗(yàn) 取蘆丁對(duì)照品溶液1 mL

9、 , 置于10 mL 容量瓶中, 加流動(dòng)相稀釋至刻度, 按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次, 每次進(jìn)樣20 L , 計(jì)算其峰面積的RSD;(3) 蘆丁含量測(cè)定 取供試品溶液, 按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定, 每次進(jìn)樣20 L ,計(jì)算其峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算含量(4) 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取供試品溶液, 按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次, 每次進(jìn)樣20 L ,計(jì)算其峰面積的RSD(5) 加樣回收率試驗(yàn) 取供試品(約相當(dāng)于蘆丁25 mg)各6 份, 分別精密加入蘆丁對(duì)照品一定量, 制成供試品溶液, 進(jìn)樣測(cè)定, 測(cè)得蘆丁片的平均回收率和RSD。六、數(shù)據(jù)記錄1. 每個(gè)分析項(xiàng)目的數(shù)據(jù)表2. 樣品分析的色譜圖七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1. 檢查流動(dòng)相是否充足，儲(chǔ)液罐要密閉；2. 流動(dòng)相有氣泡要脫氣，否則影響靈敏度；3. 待儀器穩(wěn)定后，再進(jìn)樣；4. 進(jìn)樣器要充分洗滌；不可有氣泡；2. 實(shí)驗(yàn)完成后依次用純水、100%甲醇洗滌