細(xì)胞總RNA提取操作步驟

1、細(xì)胞總RNA的提取操作步驟一、準(zhǔn)備1、物品:Trizol、氯仿(三氯甲烷)、異丙醇、75%滅酶異醇、冷PBS、1.5ml滅酶EP管、滅酶槍頭、一次性手套、EP管架、吸管2、打開冷凍離心計(jì)4?預(yù)冷二、操作步驟:Trizol、氯仿、冷PBS、EP管、滅酶槍頭、一次性手套、EP管架、吸管等物品帶入細(xì)胞室。1、取出EP管、做好標(biāo)記2、取出細(xì)胞、收集上清保留備用3、用冷PBS沖洗細(xì)胞兩次4、加入1mlTrizol(24孔板每孔加0.5ml即可)，調(diào)小刻度用移液器吹打細(xì)胞至液體澄清(生化:搖動(dòng)混勻后室溫孵育10min)5、將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml滅酶EP管中，用黃槍頭加入氯仿0.2ml(1/5Trizol

2、體積)，用手激烈震搖15秒，置室溫5min(生化:3mindxyer:15min)，分層6、4?、12000g(12300rcf)離心15min，可見分層。7、用黃槍頭小心收集上層水相約0.5ml置于另一1.5ml滅酶EP管中(保證不要吸入中間層和有機(jī)相)。8、各管分別加入0.5ml異丙醇(等體積)，用力搖勻，置室溫10min。(提前將異丙醇4?預(yù)冷，或混勻后置-20?60min，提取收效更好)9、4?、12000g離心10min，可見RNA積淀。10、倒棄上清，用濾紙吸干管口余液，加入預(yù)冷的75%滅酶異醇1ml，用指輕彈管壁使RNA積淀飄起沖洗。11、4?、7500g(7700rcf)離心5

3、min，生化為10min，(亦有dxyer用12000g)，積淀即為總RNA。12、棄上清，真空干燥約4min或空氣中干燥510min，加入20l(30l)DEPC水。56?水浴小于10min助溶，取少量測(cè)OD值，其余-70?保留備RNA制備的問題與解答1、塑料制品、玻璃和金屬物品的辦理塑料制品:盡可能使用無菌，一次性塑料制品。已注明RNase-Free的塑料制品，如沒有開封使用過，平時(shí)沒有必要再次辦理。對(duì)于國產(chǎn)塑料制品，原則上都必定辦理方可使用。辦理方法以下:在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%。注:DEPC為劇毒物，活性很強(qiáng)，小心在通風(fēng)柜中使用。將待辦理的塑料

4、制品放入一個(gè)能夠高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。在通風(fēng)柜中室溫辦理過夜。將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中，用鋁箔封住含已DEPC水辦理過的塑料制品的燒杯，高溫高壓蒸氣滅菌最少30分鐘。烘箱用合適的溫度烘拷至干燥。置于干凈處備用。玻璃和金屬物品250?C烘烤3小時(shí)以上。2、RNase是RNA制備的殺手RNase酶特別牢固，是以致RNA降解最主要的物質(zhì)。它在一些極端的條件能夠暫時(shí)失活，但限制因素去除后有迅速復(fù)性。用老例的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白控制劑都不能夠是RNase完滿失活。它廣泛存在于人的皮膚上，所以，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必定戴手

5、套。RNase的又一污染源是取液器。依照取液器制造商的要求對(duì)取液器進(jìn)行辦理。一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外面，基本達(dá)到要求。取RNase-free的物品時(shí)必定戴手套。3、采用什么方式純化總RNA,答:我們供應(yīng)多種RNA純化方式，依照您對(duì)RNA純化技術(shù)的熟悉程度，采用不同的純化手段。從產(chǎn)品使用收效看，基于TriBlue的一步法分別總RNA試劑盒(K311,K321系列)無論是新手還老手都能夠獲取比較理想的結(jié)果。若是您對(duì)苯酚過敏，出于對(duì)環(huán)境的保護(hù)，您能夠采用整個(gè)分別流程都不使用苯酚的試劑盒(K361系)。從產(chǎn)品形式上，我們的總RNA分別分醇積淀離心式和離心吸附柱方式兩

6、種。積淀方式總的產(chǎn)量比較高，純化規(guī)模靈巧，但是純度不及吸附柱方式;吸附柱方式操作比較簡單，純度高，受吸附容量的影響，產(chǎn)量收到影響。4、什么時(shí)候需要分別mRNA?答:老例RT-PCR判斷基因表達(dá)水平的，一般都能夠采用總RNA作為RT-PCR的模板，但是做cDNA文庫，克隆豐度極低的基因，大多數(shù)DD-PCR，減少雜交等需要純化的mRNA。一般用oligo(dT)-cellulose或在磁珠上偶連oligo(dT)，從組織或總RNA種直接分別mRNA。5、如何判斷分其余總RNA的純度,答:需要從兩個(gè)方面著手，缺一不能，特別是新手(1)測(cè)定OD260/OD280的比值，測(cè)準(zhǔn)時(shí)，RNA需要用10mMTr

7、is-HCl,pH7.5稀釋。理想的RNA,OD260/280在之間。比值若是過低，可能有蛋白質(zhì)污染，過高RNA可能已發(fā)生降解。(2)瓊脂糖變性電泳觀察rRNA的完滿性和強(qiáng)度。變性電泳需要采用MOPS系統(tǒng)，不能夠夠采用DNA電泳用的TBE或TAE系統(tǒng)。若是OD260/OD280過低(1.7)，平時(shí)能夠通過減少組織和細(xì)胞的用量來實(shí)現(xiàn)。6、什么時(shí)候需要加入RNA-Carrier?答:樣品很少或樣品中RNA含量低，制備RNA時(shí)需要加入必然的RNA載體，以提高RNA純化的得率。常用的載體有PolyAcrylCarrier,PolyA,PolyC和Glycogen。必然濃度范圍的Carrier對(duì)一些RN

8、A的下游應(yīng)用沒有影響，如RT-PCR,NorthernBlot。7、如何除去純化的RNA中微量的基因組DNA?答:無論用種方式制備的總RNA,要絕對(duì)保證不含基因組DNA是不現(xiàn)實(shí)的。若是您希望獲取DNAfree的RNA樣品，需要用RNasefree的DNaseI辦理。8、純化的RNA樣品如何保留,:若是希望獲取最正確的結(jié)果，純化的RNA需要立刻用于下游實(shí)驗(yàn)。RNA能夠保留在-80C冰箱，長遠(yuǎn)保留能夠置于液氮中。若是沒有-80冰箱或液氮，RNA也能夠保留在異丙醇或乙醇中，-20度保留。9、組織和細(xì)胞樣品如何收集，保留,:組織樣品收集后，需要立刻保留在液氮中，或在樣品中加入必然量的保護(hù)劑，有一些商業(yè)

9、化的產(chǎn)品能夠采用。一般實(shí)查收集50-100mg組織就足夠了。10、如何估計(jì)RNA的產(chǎn)量,:能計(jì)算出RNA的產(chǎn)量，平時(shí)都是有比很多的起資料，但是很多情況下能夠獲取資料很少，所制備獲取的RNA無法經(jīng)過分光光度的方法測(cè)定含量和濃度。RNA的含量與組織和細(xì)胞的種類有比較大的關(guān)系,同時(shí)與抽提的方式有關(guān)，比方用抽提小鼠組織100mg肝能夠獲取500ug總RNA,100mg肺獲取200ug總RNA,1百萬個(gè)細(xì)胞Hela細(xì)胞能夠獲取15ug左右的總RNA.mRNA的含量一般占總RNA含量的2-5%。依照這樣一些經(jīng)驗(yàn)值，估計(jì)出您可能獲取的量。樣品若是低于20mg或10000個(gè)細(xì)胞，在抽提時(shí)需要考慮加入合適的RN

10、A積淀載體。11、RNA制備過程中那個(gè)環(huán)節(jié)要特別注意,答:一般情況下，細(xì)胞和組織在RNA抽提液中都能夠保留一段時(shí)間，因?yàn)閹缀跛械腞NA的抽提裂解液中都含有高濃度的異硫氰酸胍等強(qiáng)變性劑,RNase基本是不起作用的，操作即即是粗放一些，也沒有多達(dá)關(guān)系。但是平時(shí)是離心后取上清，這時(shí)候RNA已沒有保護(hù)，操作要特別小心。RNA抽提指南(TRIZOL)注意事項(xiàng):*全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成RNA酶的本源。培養(yǎng)優(yōu)異的微生物實(shí)驗(yàn)操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動(dòng)吸管抽提RNA，防備使用公共儀器所以致的RNA酶交織污染。比方，使用RNA探針的實(shí)

11、驗(yàn)室可能用RNA酶A或T1來降低濾紙上的背景，所以某些非一次性的物品(如自動(dòng)吸管)可能富含RNA酶。在TRIZOL中，RNA是隔斷在RNA酶污染之外的。而對(duì)樣品的后續(xù)操作會(huì)要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿能夠在150?C的烘箱中烘烤4小時(shí)。塑料器皿能夠在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，用水完整漂洗干凈后高壓滅菌備用。抽提步驟:1(勻漿化作用經(jīng)過離心來積淀細(xì)胞后，棄上清，用移液管加TRIZOL試劑屢次吹打來裂解細(xì)胞至均一通亮的液態(tài)后，將勻漿樣品在1530?C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完滿分解。67(每51010的動(dòng)物細(xì)胞，植物或酵母菌細(xì)胞或每110細(xì)菌加1ml的TRIZ

12、OL。在加入TRIZOL前應(yīng)防備沖洗細(xì)胞因?yàn)槟菢訒?huì)增加mRNA降解的可能性。)2(分別階段每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒并將其在30?C下孵育23分鐘。在28?C下以不高出12,000g的離心力高速冷凍離心15分鐘。離心后混雜物分成三層:基層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA無一例外處存在于水樣層中間。水樣層的容量大體為所加TRIZOL容量的60%3(RNA的積淀將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中，經(jīng)過將水樣層和異丙醇混雜來積淀RNA。最初均化時(shí)的每1mlTRIZOL對(duì)應(yīng)0.5ml異丙醇。將混雜的樣品在1530?C條件下孵育10分鐘并在2

13、8?C下以不高出12,000g的離心力高速冷凍離心10分鐘。RNA積淀在離心前平時(shí)不能見，形成一膠狀片狀積淀附著于試管壁和管底。(若是希望分別DNA和蛋白，有機(jī)層同樣要予以保留。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能接踵以積淀的方式還原。乙醇積淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇能積淀出蛋白。共純化DNA對(duì)于樣品間標(biāo)準(zhǔn)化RNA的產(chǎn)量十分適用。)4(RNA的洗脫移去上層懸液。用75%的乙醇沖洗RNA積淀一次，每1ml的TRIZOL最少加1ml的75%乙醇。旋渦振蕩混雜樣品并在28?C下以不高出7,500g的離心力高速冷凍離心5分鐘。5(RNA的再溶解在操作的最后，簡單干燥RNA積淀。特

14、別重要的是，不能夠讓RNA積淀完滿干燥那樣會(huì)極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A比值1.6。用移液管尖分幾次移260/280取無RNA酶的水或0.5%SDS溶液來溶解RNA，并在5560?C下孵育10分鐘。TMRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit冰上操作:在100lEP管(經(jīng)DEPC水辦理過并消毒備用的)中加入RNA(?)0.1-5gOligo(dT)primer(0.5g/l)1lORrandonhexamerprimer(0.2g/l)1lDeionizedwaterTO12l離心混勻2(孵育:70?5min0?冰水浴立刻停止離心3(加冰上操作5reactionbuffer4lTMRiboLockRibonucleaseinhibitor(20U/l)1ldNTPmix(