沙利度胺對阿爾茨海默病秀麗隱桿線蟲模型的改善作用及機制

1、PAGE 5 -沙利度胺對阿爾茨海默病秀麗隱桿線蟲模型的改善作用及機制方亞影閻茹玉李玉賢吳宿慧李寒冰李根林關鍵詞沙利度胺;秀麗隱桿線蟲;阿爾茨海默病;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路阿爾茨海默?。ˋlzheimersdisease，AD）是一種常見的漸行性中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，患者大腦中普遍呈現腦組織萎縮、老年斑、神經元纖維纏結等病理特征1。全球AD患者正逐年遞增，目前臨床上也缺乏能有效治療AD的藥物2。沙利度胺是一種新型的免疫調節(jié)藥和抗炎藥，可抑制單核細胞和巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor-，TNF-），從而減少淀粉樣蛋白的形成;其還能抑制白細胞介素1

2、（interleukin-1，IL-1）和IL-6等炎癥因子的產生3。相關研究發(fā)現，上述炎癥因子可參與Tau蛋白的過度磷酸化，加快Tau蛋白病理形成的過程4-5。Tau蛋白的病理變化與AD患者認知能力下降有較強的相關性。Tau蛋白的正常生理功能是與微管蛋白結合，以維持細胞骨架的穩(wěn)定性6。糖原合成激酶3（glycogensynthasekinase3，GSK-3）是磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（proteinkinaseB，Akt）的下游底物，其活化后可導致Tau蛋白過度磷酸化，從而使Tau蛋白大量沉積并形成纏結，進而破壞神經元的生

3、理功能7-8。相關研究發(fā)現，激活PI3K/Akt途徑可改善神經元細胞凋亡9。秀麗隱桿線蟲（以下簡稱“線蟲”）因其生命周期短、神經系統(tǒng)結構簡單、遺傳信息清晰和易于獲得大量個體模型等優(yōu)點，常被用于神經退行性疾病的相關研究10。BR5270品系線蟲體內可表達人源Tau蛋白，具有加速Tau蛋白聚集的特點，使其從成年第1天起就出現明顯的神經元功能障礙;BR5271品系線蟲體內表現出抗Tau蛋白聚集的特點，常作為BR5270品系線蟲的對照11。另外，相關研究發(fā)現，線蟲體內PI3K和Akt的同源基因是Age-1和Akt-112-13?；诖?，本研究以BR5270品系線蟲為AD模型，研究沙利度胺改善線蟲體內T

4、au蛋白毒性及提高線蟲學習記憶能力的作用及機制，以期為沙利度胺治療AD提供實驗依據。1材料1.1主要儀器本研究所用主要儀器有HVE-50型高壓蒸汽滅菌鍋（日本Hirayama公司），DL-CJ-2ND型潔凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司），LY03-200型生化培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設備有限公司），NanoDropOneC2000型超微量紫外分光光度計、Fresco21型低溫離心機（美國ThermoFisherScientific公司），QuantStudio7Flex型逆轉錄聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國AppliedBiosystems公司），GelDocXR+型自動凝膠成像系統(tǒng)（美

5、國BioRad公司）。1.2主要藥品與試劑本研究所用主要藥品與試劑有沙利度胺片（常州制藥廠有限公司，批號19031332，規(guī)格50mg/片），二甲基亞砜（DMSO，天津市風船化學試劑科技有限公司，批號20220415），蛋白胨、瓊脂粉（北京奧博星生物技術有限公司，批號分別為20220226、20221030），酵母浸粉（美國Oxoid公司，批號分別為1267856-03），Trizol試劑（美國AmbionLife公司，批號204202），TBGreenTMPremixExTaqTM、PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser（日本Takara公司，批號分別

6、為RR820A、RR047A）。Gsk-3、Age-1、Akt-1、Clp-1基因（鈣蛋白酶的同源基因）的引物由深圳華大基因科技有限公司設計并合成（PCR引物序列及擴增產物長度見表1）。其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。1.3動物線蟲（品系包括BR5270、BR5271）均購自美國線蟲中心（https：/），大腸埃希菌EscherichiacoliOP50尿嘧啶合成缺陷菌株由北京生命科學研究所董夢秋教授課題組惠贈。2方法與結果2.1線蟲的培養(yǎng)及同期化處理2.1.1NGM培養(yǎng)基的制備稱取氯化鈉0.60g、蛋白胨0.50g、瓊脂粉3.40g，加入5mg/mL膽固醇溶液200L和純水200mL，

7、經高壓蒸汽滅菌（121，15min）后，依次加入濃度均為1mol/L的MgSO4溶液和CaCl2溶液各200L、1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）5mL，搖勻后倒板，加入100L大腸埃希菌溶液（由于線蟲以大腸埃希菌為食，故后續(xù)將其稱為“食物”）涂布均勻，于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)812h，備用。2.1.2線蟲的同期化處理將2種線蟲（BR5270、BR5271品系）置于含有食物的NGM培養(yǎng)基上培養(yǎng)（16條件下）。挑取處于產卵期的線蟲于含有食物的NGM培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4h后，移除線蟲，保留蟲卵;繼續(xù)孵育蟲卵至產卵期，即得同期化的親代線蟲，再將親代線蟲繼續(xù)培養(yǎng)至產卵期，保留蟲卵，即得同時期的蟲卵14。2

8、.2沙利度胺對BR5270品系線蟲的毒性預實驗取BR5270品系線蟲，按“2.1.2”項下方法進行同期化處理后，分為溶劑對照組（1%DMSO）和沙利度胺不同質量濃度組（10、25、50、100mg/mL），每組20條，并設個平行。將線蟲置于含不同藥物的NGM培養(yǎng)基（含食物）上，于16條件下恒溫培養(yǎng)24h后，記錄各組線蟲的死亡數量。結果顯示，溶劑對照組和沙利度胺10mg/mL組線蟲無死亡;當沙利度胺給藥質量濃度增加至25mg/mL時開始有線蟲死亡，死亡數為（1.670.58）條;沙利度胺給藥質量濃度為50、100mg/mL時，線蟲死亡數分別為（5.001.00）、（17.342.52）條。這提示

9、沙利度胺對線蟲的毒性隨著質量濃度的增加而增強。因此，為了避免線蟲毒理學特征的出現，本研究將沙利度胺最大給藥質量濃度定為15mg/mL。46B59788-B242-477C-9FBC-8A13E7CD146F2.3BR5270品系線蟲的基礎慢反應實驗BR5270品系線蟲由于Tau蛋白的聚集，表現為從成年第1天開始就運動不協(xié)調、運動神經元軸突缺損11，因此，通過測定線蟲的擺動次數，可探究沙利度胺對BR5270品系線蟲運動能力的影響。按“2.1.2”項下方法將BR5271、BR5270品系線蟲進行同期化處理，然后于16條件下培養(yǎng)24h后，將BR5271品系線蟲作為對照組，BR5270品系線蟲分為空白組（不加藥物）和沙利度胺不同質量濃度組（0.5、2.0、6.0、15.0mg/mL），每組30條，并設3個平行。將線蟲置于含不同藥物的NGM培養(yǎng)基（含食物）上，于16條件下培養(yǎng)至成年（培養(yǎng)5d）后，測定各組線蟲30s內的擺動次數15。采用GraphPadPrism8.0.2統(tǒng)計軟件作圖，以SPSS24