LAMP環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法技術(shù)臨床應(yīng)用課件

1、LAMP環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法技術(shù)臨床應(yīng)用此PPT下載后可自行編輯修改醫(yī)者人之司命，如大將提兵，必謀定而后戰(zhàn)。LAMP環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法技術(shù)臨床應(yīng)用此PPT下載后可自行編輯開(kāi)始啦！請(qǐng)將手機(jī)調(diào)成靜音，如有疑問(wèn)可以隨時(shí)打斷我！開(kāi)始啦！請(qǐng)將手機(jī)調(diào)成靜音，如有疑問(wèn)可以隨時(shí)打斷我！LAMP技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop mediated isothermal amplification , LAMP ) ,是一種在恒定溫度下實(shí)現(xiàn)核酸的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增的技術(shù)已經(jīng)被用來(lái)快速檢測(cè)動(dòng)物病原(病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng))LAMP技術(shù)因其特異、敏感、簡(jiǎn)便、快捷、檢測(cè)方式對(duì)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施、設(shè)備的要求較少，逐步用于結(jié)核分枝桿菌診斷鑒別中世界

2、衛(wèi)生組織于2016年8月11日，在日內(nèi)瓦發(fā)布了一份最新的推薦書，推薦發(fā)展中國(guó)家的基礎(chǔ)醫(yī)療單位使用該方法，可以作為痰涂片檢測(cè)方法的替代方案LAMP技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop mediated 縣區(qū)級(jí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增多色巢氏熒光PCR法交叉引物發(fā)RNA等溫?cái)U(kuò)增法等省、自治區(qū)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)是否對(duì)利福平和異煙肼耐藥地市級(jí)結(jié)核分枝桿菌及是否對(duì)利福平和異煙肼耐藥基因芯片溶解曲線線性探針“十三五”規(guī)劃要求逐步推廣的新診斷技術(shù)縣區(qū)級(jí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌省、自治區(qū)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌地市級(jí)結(jié)核分LAMP技術(shù)的原理 對(duì)靶基因的6個(gè)特異部位設(shè)定4種引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條

3、件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增。LAMP技術(shù)的原理LAMP法使用的酶鏈置換型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase擴(kuò)增對(duì)象為雙鏈DNA時(shí)，其中一條鏈解離的同時(shí)進(jìn)行鏈延長(zhǎng)。LAMP法使用最適溫度65的聚合酶。27 九月 2022LAMP法使用的酶鏈置換型DNA聚合酶: Bst DNA PLAMP法的引物設(shè)計(jì)27 九月 2022LAMP法的引物設(shè)計(jì)26 九月 2022LAMP法的原理27 九月 2022LAMP法的原理26 九月 2022LAMP法的原理27 九月 2022LAMP法的原理26 九月 2022LAMP技術(shù)特點(diǎn)靈敏度高LAMP一般能檢測(cè)到比PCR低

4、10倍的拷貝數(shù)，擴(kuò)增模板可低至每測(cè)試10拷貝或更少。特異性強(qiáng)通過(guò)4對(duì)引物與靶序列上的6個(gè)特異部位準(zhǔn)確結(jié)合來(lái)產(chǎn)生擴(kuò)增效應(yīng),因此能獲得比PCR更高的特異性。速度快恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng),沒(méi)有PCR反應(yīng)中溫度變化的耗時(shí),省卻溫度循環(huán)，在30min60min內(nèi)即可完成反應(yīng)過(guò)程。設(shè)備簡(jiǎn)單只需一個(gè)簡(jiǎn)單的恒溫器,不需要昂貴的PCR儀。產(chǎn)物檢測(cè)便捷在合成DNA的同時(shí)產(chǎn)生的大量焦磷酸根離子,與鎂離子結(jié)合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，從而能定性判斷LAMP反應(yīng)；可與熒光物質(zhì)結(jié)合。LAMP技術(shù)特點(diǎn)靈敏度高LAMP一般能檢測(cè)到比PCR低10倍LAMP法和其他PCR法的比較27 九月 2022LAMP法和其他PCR法的比較26 九月

5、2022LAMP法和其他PCR法的比較27 九月 2022LAMP法和其他PCR法的比較26 九月 2022LAMP法所需的試劑27 九月 2022LAMP法所需的試劑26 九月 202227 九月 2022LAMP技術(shù)簡(jiǎn)介 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是由日本研究人員發(fā)明的一種新型的體外等溫?cái)U(kuò)增特異核酸片段的技術(shù)。該技術(shù)可以在等溫條件下（約65）進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，克服了傳統(tǒng)PCR反應(yīng)需要通過(guò)反復(fù)的熱變性過(guò)程獲得單鏈模板的缺點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下進(jìn)行連續(xù)快速的核酸擴(kuò)增，并且可以通過(guò)簡(jiǎn)易直觀的目測(cè)判讀結(jié)果，相比傳統(tǒng)

6、PCR大大節(jié)省了時(shí)間和實(shí)驗(yàn)操作步驟。26 九月 2022LAMP技術(shù)簡(jiǎn)介 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技LAMP法常規(guī)操作步驟27 九月 2022LAMP法常規(guī)操作步驟26 九月 2022LAMP法的檢測(cè)方法瓊脂糖凝膠電泳法 由LAMP原理可知，LAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物是莖環(huán)DNA組成的混合物，即有若干倍莖長(zhǎng)度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和類似花椰菜的結(jié)構(gòu)。因此，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在2的瓊脂糖凝膠糖上呈現(xiàn)的是典型的梯狀條帶。（圖A）肉眼觀察法 在LAMP反應(yīng)過(guò)程中，可以通過(guò)產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀的產(chǎn)生來(lái)肉眼直接判斷擴(kuò)增反應(yīng)是否進(jìn)行。（圖B）通過(guò)熒光染料檢測(cè) 有時(shí)，通過(guò)肉眼觀察白色沉淀來(lái)檢測(cè)會(huì)存在一定的誤差，所以也可通過(guò)

7、添加熒光染料，如溴化乙錠(EB)、SYBR GreenI等進(jìn)行染色，來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增是否發(fā)生。（圖C）27 九月 2022LAMP法的檢測(cè)方法瓊脂糖凝膠電泳法26 九月 202227 九月 202226 九月 2022LAMP法在結(jié)核菌檢測(cè)中的應(yīng)用27 九月 2022靶標(biāo)限定: 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群gyrB基因作為結(jié)核分枝桿菌重要的功能基因，在復(fù)合群進(jìn)化過(guò)程中非常保守，LAMP法檢測(cè)即以gyrB基因作為靶標(biāo)。臨床上感染人類的是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡氏分枝桿菌。對(duì)檢測(cè)對(duì)象的準(zhǔn)確限定能避免假陽(yáng)性過(guò)高而增加治療成本，長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)說(shuō)，更有利于避免耐藥性的產(chǎn)生

8、。LAMP法在結(jié)核菌檢測(cè)中的應(yīng)用26 九月 2022靶標(biāo)限定:LAMP法在結(jié)核菌檢測(cè)中的應(yīng)用27 九月 2022適宜的檢測(cè)對(duì)象以臨床上引起結(jié)核感染的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群為檢測(cè)對(duì)象，可避免假陽(yáng)性過(guò)高。 反應(yīng)管預(yù)裝反應(yīng)體系擴(kuò)增及檢測(cè)在全封閉反應(yīng)管中進(jìn)行，有效降低氣溶膠污染；用戶操作簡(jiǎn)便、減少操作誤差。結(jié)果易讀產(chǎn)物和顯色液直接顯色即可肉眼判斷結(jié)果。技術(shù)特點(diǎn)：LAMP法在結(jié)核菌檢測(cè)中的應(yīng)用26 九月 2022適宜的檢測(cè)LAMP法在結(jié)核菌檢測(cè)中的應(yīng)用27 九月 2022臨床試驗(yàn) LAMP法和對(duì)照試劑（BD快速培養(yǎng)）對(duì)比結(jié)果靈敏度89.54% 陽(yáng)性結(jié)果預(yù)期值98.13% 特異性98.93% 陰性結(jié)果預(yù)期值9

9、3.77% 總符合率95.31%LAMP法在結(jié)核菌檢測(cè)中的應(yīng)用26 九月 2022臨床試驗(yàn)LAMP法在結(jié)核菌檢測(cè)中的應(yīng)用27 九月 2022臨床試驗(yàn) LAMP法和對(duì)照試劑（TB-qPCR）對(duì)比結(jié)果陽(yáng)性一致率=88.56% 陰性一致率=93.06% 總符合率=91.36%LAMP法在結(jié)核菌檢測(cè)中的應(yīng)用26 九月 2022臨床試驗(yàn)WHO 認(rèn)為L(zhǎng)AMP法的檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于痰涂片檢測(cè)。在已有肺結(jié)核癥狀的檢測(cè)者中進(jìn)行對(duì)比，TB-LAMP法比痰涂片檢測(cè)法多檢出15%的患者。對(duì)比WHO近年推薦的其它快速檢測(cè)法，如果把TB-LAMP法用于對(duì)痰涂片檢測(cè)陰性患者的復(fù)查，TB-LAMP法檢出率要高40%。27 九月 2

10、022WHO 認(rèn)為L(zhǎng)AMP法的檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于痰涂片檢測(cè)。在已有肺結(jié)核27 九月 2022LAMP法在結(jié)核菌檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)有結(jié)核診斷方法和環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法比較26 九月 2022LAMP法在結(jié)核菌檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)有結(jié)核診痰標(biāo)本目測(cè)法檢測(cè)流程100分鐘 痰標(biāo)本目測(cè)法檢測(cè)流程100分鐘 一、樣品處理 1、用23倍體積的4%NaOH溶液消化痰液2、吸取1mL痰液液化液加入無(wú)菌1.5mL離心管中一、樣品處理 1、用23倍體積的4%NaOH溶液消化痰液一、樣品處理 2、13000r/min離心10min，盡量吸棄上清一、樣品處理 2、13000r/min離心10min，盡量吸一、樣品處理3、沉淀用1mL生理鹽

11、水重懸洗滌一、樣品處理3、沉淀用1mL生理鹽水重懸洗滌一、樣品處理4、13000r/min離心10min，盡量吸棄上清5、重復(fù)步驟3、4一次一、樣品處理4、13000r/min離心10min，盡量吸棄一、樣品處理6、向含沉淀物的離心管分別加入100L DNA提取液，混勻后沸水浴10min一、樣品處理6、向含沉淀物的離心管分別加入100L DNA一、樣品處理7、冷卻至室溫后， 13000 r/min離心5min，上清即為核酸模板一、樣品處理7、冷卻至室溫后， 13000 r/min離心二、核酸擴(kuò)增1、向反應(yīng)管內(nèi)按順序分別加入陰性對(duì)照、待檢模板和陽(yáng)性對(duì)照各2.5L，注意加樣時(shí)槍頭要穿透穩(wěn)定液層加至

12、反應(yīng)管大腔內(nèi)，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，移至反應(yīng)區(qū)二、核酸擴(kuò)增1、向反應(yīng)管內(nèi)按順序分別加入陰性對(duì)照、待檢模板和二、核酸擴(kuò)增2、置65恒溫反應(yīng)60min 二、核酸擴(kuò)增2、置65恒溫反應(yīng)60min 三、結(jié)果判斷1、反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)管倒置甩動(dòng)2次，再正置甩動(dòng)2次，使工作液與顯色液充分混合三、結(jié)果判斷1、反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)管倒置甩動(dòng)2次，再正置甩動(dòng)2三、結(jié)果判斷2、在陰性對(duì)照反應(yīng)管液體顏色為無(wú)色（或橙色），陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)管液體顏色呈綠色的條件下： 若待檢樣本反應(yīng)管中液體顏色呈綠色，則可報(bào)告該樣本檢測(cè)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性； 若待檢樣本反應(yīng)管中液體顏色為無(wú)色（或橙色），則可報(bào)告該樣本檢測(cè)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陰性；

13、若陰陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，應(yīng)重新檢測(cè)。三、結(jié)果判斷2、在陰性對(duì)照反應(yīng)管液體顏色為無(wú)色（或橙色），陽(yáng)（1）LAMP結(jié)果為陽(yáng)性，涂片結(jié)果也為陽(yáng)性?？勺龀龌颊咭伤苹加薪Y(jié)核病的診斷，并開(kāi)始抗結(jié)核治療，同時(shí)等待培養(yǎng)結(jié)果。（2）LAMP結(jié)果陽(yáng)性，而涂片結(jié)果為陰性。根據(jù)臨床癥狀判斷是否開(kāi)始抗結(jié)核治療，同時(shí)等待培養(yǎng)結(jié)果。這時(shí)可考慮增加一個(gè)或一個(gè)以上的標(biāo)本進(jìn)行LAMP檢測(cè)以確認(rèn)。如果增加的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果也為陽(yáng)性，則患者可被初步診斷為患有結(jié)核病，并等待培養(yǎng)的結(jié)果。（3）LAMP結(jié)果為陰性，涂片結(jié)果為陽(yáng)性。應(yīng)考慮LAMP結(jié)果是否受痰標(biāo)本中的抑制物影響，并增加一個(gè)或一個(gè)以上的標(biāo)本檢測(cè)。若增加的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果仍不變，且排除抑制物因素，則患者可初步考慮為非結(jié)核分枝桿菌感染，進(jìn)行進(jìn)一步確診實(shí)驗(yàn)。（4）LAMP結(jié)果為陰性，涂片結(jié)果亦為陰性。根據(jù)臨床癥狀判斷是否開(kāi)始抗結(jié)核治療，并等待培養(yǎng)結(jié)果。（5）隨訪患者 LAM