MMFSCNJ出口食品中蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)方法

1、MMFSCNJ出口食品中蠟樣芽孢桿菌查驗(yàn)方法MMFSCNJ出口食品中蠟樣芽孢桿菌查驗(yàn)方法3/3MMFSCNJ出口食品中蠟樣芽孢桿菌查驗(yàn)方法MM_FS_CNJ_0158出口食品蠟樣芽孢桿菌微生物法MM_FS_CNJ_0158出口食品中蠟樣芽孢桿菌查驗(yàn)方法合用范圍本方法合用于出口食品的查驗(yàn)。培育基和儀器培育基甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂(MYP)；胰酪胨大豆多粘菌素肉湯；酚紅葡萄糖肉湯；硝酸鹽肉湯；營(yíng)養(yǎng)瓊脂；l-酪氨酸營(yíng)養(yǎng)瓊脂；溶菌酶營(yíng)養(yǎng)肉湯；改進(jìn)V-P培育基；動(dòng)力培育基；胰酪胨大豆羊血瓊脂(TSSB)；Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液；亞硝酸鹽試劑；V-P試劑；堿性復(fù)紅染色液。2.2.儀器吸管

2、：容量1.0mL和10.0mL，具0.1mL刻度；菌落計(jì)數(shù)器；均質(zhì)器；厭氧培育裝置；渦動(dòng)攪拌器；形玻璃棒；恒溫培育箱：30及361。樣品的保留和送檢待檢樣品應(yīng)保持在6以下運(yùn)送并盡可能不使其冷凍。送到實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)保存于4并趕快進(jìn)行查驗(yàn)。如在4d內(nèi)不可以進(jìn)行查驗(yàn)，應(yīng)將樣品積蓄在20，查驗(yàn)前再于室溫下解凍。脫水食品可在常溫下送檢和積蓄。樣品的制備4.1.以無(wú)菌操作用滅菌刀、剪將樣品剪碎。稱取50g放于無(wú)菌均質(zhì)杯中。4.2.加450mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖稀釋液于均質(zhì)杯中以1800020000r/min均質(zhì)2min。制成110樣品稀釋液。4.3.取110稀釋液10.0mL加到含有90.0mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液

3、的稀釋瓶中，充分混勻制成1100的稀釋液。4.4.每個(gè)稀釋度換用1支10.0mL滅菌吸管，按上述操作程序進(jìn)行10倍遞加稀釋直至106。查驗(yàn)步驟5.1.平板計(jì)數(shù)法取各稀釋液0.1mL接種到MYP瓊脂平板上。用滅菌L形玻璃棒均勻涂布于整個(gè)瓊脂表面。每稀釋度接種兩個(gè)MYP瓊脂平板。將平板置于30培育24h。采用擁有15150個(gè)典型或可疑蠟樣芽孢桿菌菌落的平板，進(jìn)行計(jì)數(shù)。并計(jì)算同一稀釋度兩個(gè)平板的均勻菌落數(shù)。蠟樣芽孢桿菌在MYP瓊脂平板上生成的菌落為微粉紅色，圍繞產(chǎn)生卵磷脂酶積淀環(huán)。如反響不典型，可連續(xù)培育24h再計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)后，從每個(gè)平板最少采用5個(gè)已計(jì)數(shù)的菌落分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，于30培育24h

4、，按第6章進(jìn)行證明試驗(yàn)。依據(jù)證明試驗(yàn)確立為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，按比率計(jì)算出該皿內(nèi)的蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)，此后乘其稀釋倍數(shù)再乘以10，即得每克樣品所含蠟樣芽孢桿菌數(shù)并作出報(bào)告。例：將檢樣104稀釋液0.1mL涂布于MYP瓊脂平板上，生成的可疑菌落數(shù)為25個(gè)，取5個(gè)進(jìn)行判斷，證明為蠟樣芽孢桿菌的是4個(gè)，則1g樣品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)為(254/5)104102106。5.2.近來(lái)似值(MPN)法合用于污染蠟樣芽孢桿菌數(shù)不大于103個(gè)/g的食品。采用三管法MPN系列。取101、102、103三種稀釋液，每種稀釋液接種3管胰酪胨大豆多粘菌素肉湯，每管接種1mL。置于30培育482h。從長(zhǎng)菌的試管取培育物劃

5、線接種到MYP瓊脂平板上。置30培育2448h。從MYP瓊脂平板上挑取粉紅色繞有積淀環(huán)的單個(gè)菌落，接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，置30培育24h，供作證明試驗(yàn)。依據(jù)證明試驗(yàn)確立為蠟樣芽孢桿菌的管數(shù)，由MPN表附錄C(增補(bǔ)件)計(jì)算蠟樣芽孢桿菌的MPN值/g，并作出報(bào)告。證明試驗(yàn)形態(tài)察看取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培育物，作革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性大桿菌，呈短鏈或長(zhǎng)鏈，芽孢呈橢圓形位于菌體中央或偏端，不使菌體脹大。生化學(xué)性狀葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)：接種于酚紅葡萄糖肉湯中，厭氧條件下35培育24h。培育基應(yīng)由紅色變成黃色(表示本菌在厭氧條件下分解葡萄糖產(chǎn)酸)。硝酸鹽復(fù)原試驗(yàn)：接種于硝酸鹽肉湯中，35培育24h。加硝酸

6、鹽試劑后應(yīng)為陽(yáng)性反響(紅色)。V-P試驗(yàn)：接種于改進(jìn)V-P培育基中，35培育48h。加V-P試劑及肌酸數(shù)粒，靜止1h，應(yīng)為陽(yáng)性反響(伊紅色)。L-酪氨酸分解試驗(yàn)：接種于L-酪氨酸瓊脂培育基上，35培育48h，陽(yáng)性反響菌落四周培育基應(yīng)出現(xiàn)澄清透明區(qū)(表示產(chǎn)生酪蛋白酶)。陰性時(shí)應(yīng)連續(xù)培育72h再察看。溶菌酶試驗(yàn)：用直徑2mm接種環(huán)取純菌懸液一環(huán)，接種于溶菌酶肉湯中，35培育24h。該菌在本培育基(含0.001%的溶菌酶)中能生長(zhǎng)。如出現(xiàn)陰性反響，應(yīng)連續(xù)培育24h。卵磷脂酶試驗(yàn)：接種于MYP瓊脂平板上，35培育24h。陽(yáng)性反響菌落四周應(yīng)出現(xiàn)積淀環(huán)(表示產(chǎn)生卵磷脂酶)。6.3.蠟樣芽孢桿菌與近似菌的鑒

7、識(shí)試驗(yàn)動(dòng)力試驗(yàn)：用接種針挑取培育物穿刺接種于動(dòng)力培育基中，30培育24h。有動(dòng)力蠟樣芽孢桿菌應(yīng)沿穿刺線呈擴(kuò)散生長(zhǎng)，而蕈狀芽孢桿菌經(jīng)常呈絨毛狀生長(zhǎng)，形成所謂的蜂巢狀擴(kuò)散。也可用懸滴法檢查。蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌平常運(yùn)動(dòng)極為開(kāi)朗，而炭疽桿菌則不運(yùn)動(dòng)。根狀生長(zhǎng)試驗(yàn)：用接種環(huán)取培育物接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，30培育1824h。蠟樣芽孢桿菌群的多半菌株形成粗拙的似毛玻璃狀或融蠟狀的菌落。此中獨(dú)一蕈狀芽孢桿菌則形成根狀生長(zhǎng)的特點(diǎn)。溶血試驗(yàn)：取培育物接種于胰酪胨大豆羊血瓊脂平板上，3032培育24h。蠟樣芽孢桿菌落四周表現(xiàn)型完滿溶血的溶血環(huán)。蘇云金芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌表現(xiàn)弱的溶血現(xiàn)象，而炭疽芽孢桿菌平常為不溶血。蛋白質(zhì)結(jié)晶毒素試驗(yàn)：取經(jīng)30培育24h并于室溫?cái)R置23d的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培育物少量于載玻片上，滴加蒸餾水混涂成薄膜。經(jīng)自然干燥，微火固定后，于涂膜加甲醇半分鐘后傾掉，再經(jīng)過(guò)分焰干燥，于載片上滴滿0.5%堿性復(fù)紅液，縱火焰上加熱微見(jiàn)蒸氣(勿使染液沸騰)后連續(xù)1.5min，移去火焰，使載片擱置0.5min再傾去染液。用干凈自來(lái)水完滿沖洗、晾干、鏡檢。察看有無(wú)游離芽孢和染成黑色的菱形毒素結(jié)晶體。如發(fā)現(xiàn)游離芽孢形成的不豐富，應(yīng)將培育物置室溫23d再行檢查。蘇云金芽孢桿菌用此法檢測(cè)為陽(yáng)性，而蠟樣芽孢桿菌群的其余