MMFSCNJ出口食品中蠟樣芽孢桿菌檢驗方法

1、MMFSCNJ出口食品中蠟樣芽孢桿菌查驗方法MMFSCNJ出口食品中蠟樣芽孢桿菌查驗方法3/3MMFSCNJ出口食品中蠟樣芽孢桿菌查驗方法MM_FS_CNJ_0158出口食品蠟樣芽孢桿菌微生物法MM_FS_CNJ_0158出口食品中蠟樣芽孢桿菌查驗方法合用范圍本方法合用于出口食品的查驗。培育基和儀器培育基甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂(MYP)；胰酪胨大豆多粘菌素肉湯；酚紅葡萄糖肉湯；硝酸鹽肉湯；營養(yǎng)瓊脂；l-酪氨酸營養(yǎng)瓊脂；溶菌酶營養(yǎng)肉湯；改進V-P培育基；動力培育基；胰酪胨大豆羊血瓊脂(TSSB)；Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液；亞硝酸鹽試劑；V-P試劑；堿性復紅染色液。2.2.儀器吸管

2、：容量1.0mL和10.0mL，具0.1mL刻度；菌落計數(shù)器；均質(zhì)器；厭氧培育裝置；渦動攪拌器；形玻璃棒；恒溫培育箱：30及361。樣品的保留和送檢待檢樣品應(yīng)保持在6以下運送并盡可能不使其冷凍。送到實驗室后，應(yīng)保存于4并趕快進行查驗。如在4d內(nèi)不可以進行查驗，應(yīng)將樣品積蓄在20，查驗前再于室溫下解凍。脫水食品可在常溫下送檢和積蓄。樣品的制備4.1.以無菌操作用滅菌刀、剪將樣品剪碎。稱取50g放于無菌均質(zhì)杯中。4.2.加450mL無菌磷酸鹽緩沖稀釋液于均質(zhì)杯中以1800020000r/min均質(zhì)2min。制成110樣品稀釋液。4.3.取110稀釋液10.0mL加到含有90.0mL無菌磷酸鹽緩沖液

3、的稀釋瓶中，充分混勻制成1100的稀釋液。4.4.每個稀釋度換用1支10.0mL滅菌吸管，按上述操作程序進行10倍遞加稀釋直至106。查驗步驟5.1.平板計數(shù)法取各稀釋液0.1mL接種到MYP瓊脂平板上。用滅菌L形玻璃棒均勻涂布于整個瓊脂表面。每稀釋度接種兩個MYP瓊脂平板。將平板置于30培育24h。采用擁有15150個典型或可疑蠟樣芽孢桿菌菌落的平板，進行計數(shù)。并計算同一稀釋度兩個平板的均勻菌落數(shù)。蠟樣芽孢桿菌在MYP瓊脂平板上生成的菌落為微粉紅色，圍繞產(chǎn)生卵磷脂酶積淀環(huán)。如反響不典型，可連續(xù)培育24h再計數(shù)。計數(shù)后，從每個平板最少采用5個已計數(shù)的菌落分別接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，于30培育24h

4、，按第6章進行證明試驗。依據(jù)證明試驗確立為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，按比率計算出該皿內(nèi)的蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)，此后乘其稀釋倍數(shù)再乘以10，即得每克樣品所含蠟樣芽孢桿菌數(shù)并作出報告。例：將檢樣104稀釋液0.1mL涂布于MYP瓊脂平板上，生成的可疑菌落數(shù)為25個，取5個進行判斷，證明為蠟樣芽孢桿菌的是4個，則1g樣品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)為(254/5)104102106。5.2.近來似值(MPN)法合用于污染蠟樣芽孢桿菌數(shù)不大于103個/g的食品。采用三管法MPN系列。取101、102、103三種稀釋液，每種稀釋液接種3管胰酪胨大豆多粘菌素肉湯，每管接種1mL。置于30培育482h。從長菌的試管取培育物劃

5、線接種到MYP瓊脂平板上。置30培育2448h。從MYP瓊脂平板上挑取粉紅色繞有積淀環(huán)的單個菌落，接種營養(yǎng)瓊脂斜面，置30培育24h，供作證明試驗。依據(jù)證明試驗確立為蠟樣芽孢桿菌的管數(shù)，由MPN表附錄C(增補件)計算蠟樣芽孢桿菌的MPN值/g，并作出報告。證明試驗形態(tài)察看取營養(yǎng)瓊脂斜面培育物，作革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽孢桿菌為革蘭氏陽性大桿菌，呈短鏈或長鏈，芽孢呈橢圓形位于菌體中央或偏端，不使菌體脹大。生化學性狀葡萄糖發(fā)酵試驗：接種于酚紅葡萄糖肉湯中，厭氧條件下35培育24h。培育基應(yīng)由紅色變成黃色(表示本菌在厭氧條件下分解葡萄糖產(chǎn)酸)。硝酸鹽復原試驗：接種于硝酸鹽肉湯中，35培育24h。加硝酸

6、鹽試劑后應(yīng)為陽性反響(紅色)。V-P試驗：接種于改進V-P培育基中，35培育48h。加V-P試劑及肌酸數(shù)粒，靜止1h，應(yīng)為陽性反響(伊紅色)。L-酪氨酸分解試驗：接種于L-酪氨酸瓊脂培育基上，35培育48h，陽性反響菌落四周培育基應(yīng)出現(xiàn)澄清透明區(qū)(表示產(chǎn)生酪蛋白酶)。陰性時應(yīng)連續(xù)培育72h再察看。溶菌酶試驗：用直徑2mm接種環(huán)取純菌懸液一環(huán)，接種于溶菌酶肉湯中，35培育24h。該菌在本培育基(含0.001%的溶菌酶)中能生長。如出現(xiàn)陰性反響，應(yīng)連續(xù)培育24h。卵磷脂酶試驗：接種于MYP瓊脂平板上，35培育24h。陽性反響菌落四周應(yīng)出現(xiàn)積淀環(huán)(表示產(chǎn)生卵磷脂酶)。6.3.蠟樣芽孢桿菌與近似菌的鑒

7、識試驗動力試驗：用接種針挑取培育物穿刺接種于動力培育基中，30培育24h。有動力蠟樣芽孢桿菌應(yīng)沿穿刺線呈擴散生長，而蕈狀芽孢桿菌經(jīng)常呈絨毛狀生長，形成所謂的蜂巢狀擴散。也可用懸滴法檢查。蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌平常運動極為開朗，而炭疽桿菌則不運動。根狀生長試驗：用接種環(huán)取培育物接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，30培育1824h。蠟樣芽孢桿菌群的多半菌株形成粗拙的似毛玻璃狀或融蠟狀的菌落。此中獨一蕈狀芽孢桿菌則形成根狀生長的特點。溶血試驗：取培育物接種于胰酪胨大豆羊血瓊脂平板上，3032培育24h。蠟樣芽孢桿菌落四周表現(xiàn)型完滿溶血的溶血環(huán)。蘇云金芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌表現(xiàn)弱的溶血現(xiàn)象，而炭疽芽孢桿菌平常為不溶血。蛋白質(zhì)結(jié)晶毒素試驗：取經(jīng)30培育24h并于室溫擱置23d的營養(yǎng)瓊脂培育物少量于載玻片上，滴加蒸餾水混涂成薄膜。經(jīng)自然干燥，微火固定后，于涂膜加甲醇半分鐘后傾掉，再經(jīng)過分焰干燥，于載片上滴滿0.5%堿性復紅液，縱火焰上加熱微見蒸氣(勿使染液沸騰)后連續(xù)1.5min，移去火焰，使載片擱置0.5min再傾去染液。用干凈自來水完滿沖洗、晾干、鏡檢。察看有無游離芽孢和染成黑色的菱形毒素結(jié)晶體。如發(fā)現(xiàn)游離芽孢形成的不豐富，應(yīng)將培育物置室溫23d再行檢查。蘇云金芽孢桿菌用此法檢測為陽性，而蠟樣芽孢桿菌群的其余