轉(zhuǎn)染技術(shù)原理應用

1、慣例轉(zhuǎn)染技術(shù)分為兩大類，一類是剎時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)固轉(zhuǎn)染（永遠轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，所以一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但往常只連續(xù)幾日，多用于啟動子和其余調(diào)控元件的剖析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時內(nèi)（依靠于各樣不一樣的建立）剖析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩(wěn)固轉(zhuǎn)染，外源DNA既能夠整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。只管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大概1/104轉(zhuǎn)染細胞能整合，往常需要經(jīng)過一些

2、選擇性標志，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等頻頻挑選，獲取穩(wěn)固轉(zhuǎn)染的同源細胞系。轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，很多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細胞數(shù)目，培育及檢測時間等。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如DEAE右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質(zhì)體法各有益弊，其主要原理及應用特色見下表：轉(zhuǎn)染方法原理應用特色磷酸鈣DNA復合物吸附穩(wěn)固轉(zhuǎn)染不合用于原代細胞磷酸鈣法操作簡易但重復性差細胞膜被細胞內(nèi)吞剎時性轉(zhuǎn)染有些細胞不合用帶正電的DEAE右-旋糖相對簡易、結(jié)果可重復DEAE右-旋糖苷苷與核酸帶負電的磷酸剎時性轉(zhuǎn)染但對細胞有必定的毒副作

3、用法骨架互相作用形成的復轉(zhuǎn)染時需除血清合物被細胞內(nèi)吞高脈沖電壓損壞細胞膜穩(wěn)固轉(zhuǎn)染合用性廣但細胞致死率高，DNA和電穿孔法電位，DNA經(jīng)過膜上形成剎時性轉(zhuǎn)染細胞用量大，需依據(jù)不一樣細胞類的小孔導入全部細胞型優(yōu)化電穿孔實驗條件病毒介導法經(jīng)過侵染宿主細胞將外穩(wěn)固轉(zhuǎn)染可用于難轉(zhuǎn)染的細胞、原代細胞，源基因整合到染色體中體內(nèi)細胞等特定宿主細但攜帶基因不可以太大細胞需處罰逆轉(zhuǎn)錄病毒裂期胞需考慮安全要素經(jīng)過侵染宿主細胞將外剎時轉(zhuǎn)染可用于難轉(zhuǎn)染的細胞腺病毒特定宿主細源基因整合到染色體中需考慮安全要素胞陽離子脂質(zhì)體帶正電的脂質(zhì)體與核酸穩(wěn)固轉(zhuǎn)染合用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復性好，帶負電的磷酸基團形成剎時性轉(zhuǎn)染但轉(zhuǎn)染時需

4、除血清。轉(zhuǎn)染成效隨細法復合物被細胞內(nèi)吞全部細胞胞種類變化大將DNA用顯微重金屬顆Biolistic顆粒粒積淀，再將包被好的可用于：人的表皮細胞，纖維原細顆粒用彈道裝置投射入剎時性轉(zhuǎn)染傳達法胞，淋巴細胞系以及原代細胞細胞，DNA在胞內(nèi)逐漸釋放，表達顯微注射法用顯微操作將DNA直接穩(wěn)固轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染細胞數(shù)有限,多用于工程改造注入靶細胞核剎時性轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)基因動物的胚胎細胞（各樣轉(zhuǎn)染方法的比較）?除上述傳統(tǒng)方法外，近來幾年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，以其合用宿主范圍廣，操作簡易，對細胞毒性小，轉(zhuǎn)染效率高遇到研究者們的喜愛。此中樹枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethyl

5、enimine，PEI）的轉(zhuǎn)染性能最正確，但樹枝狀聚合物的構(gòu)造不易于進一步改性，且其合成工藝復雜。聚乙烯亞胺是一種擁有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，每相隔二個碳個原子，即每“第三個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充任有效的“質(zhì)子海綿”(protonsponge)體。這類聚陽離子能將各樣報告基因轉(zhuǎn)入各樣種屬細胞，其成效好于脂質(zhì)聚酰胺，經(jīng)進一步的改性后，其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物，并且它的細胞毒性低。大批實考證明，PEI是特別有希望的基因治療載體。當前在設(shè)計更復雜的基因載體時，PEI經(jīng)常做為核心構(gòu)成成分。線型PEI（LinePEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體

6、的研究比分枝狀PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，過去的研究以為在不考慮詳細條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復合物的細胞毒性較低，有益于細胞定位，所以與BPEI對比應當轉(zhuǎn)染效率高一些。但近來研究表BPEI的分枝度高有益于形成小的轉(zhuǎn)染復合物，進而提升轉(zhuǎn)染效率，但同時細胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發(fā)現(xiàn)這類PEI的毒性低，但轉(zhuǎn)染效率卻較高。GenEscort是采納各樣分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各樣含有生理條件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝構(gòu)造使得其擁有較高的正電性，所以易于高效地

7、包裹各樣DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒，進而提升轉(zhuǎn)染效率，當所形成復合物進入細胞此后，此中所含的生理條件下可降解的化學鍵在細胞內(nèi)水解，使交聯(lián)聚合物分解為無細胞毒性的小分子PEI，這樣構(gòu)造的轉(zhuǎn)染試劑在體外應用能夠獲取高的轉(zhuǎn)染效率和低的細胞毒性，其可降解性對體內(nèi)應用也擁有重要的意義。影響轉(zhuǎn)染實驗的要素轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術(shù)。跟著分子生物學和細胞生物學研究的不停發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細胞基因功能的慣例工具。在研究基因功能、調(diào)控基因表達、突變剖析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學試驗中，其應用愈來愈寬泛。影響轉(zhuǎn)染效率的要素有好多，細胞株自己的特征和活性，細胞培

8、育條件，轉(zhuǎn)染的DNA或RNA的質(zhì)量，轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染試劑的選擇等。慣例轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是剎時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)固轉(zhuǎn)染（永遠轉(zhuǎn)染）。前者外DNA/RNA不整合到宿主染色體中，所以一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但往常只連續(xù)幾日，多用于啟動子和其余調(diào)控元件的剖析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時內(nèi)（依靠于各樣不一樣的建立）剖析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，-半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩(wěn)固轉(zhuǎn)染，外源DNA既能夠整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。只管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合

9、到染色體中概率很小，大概1/104轉(zhuǎn)染細胞能整合，往常需要經(jīng)過一些選擇性標志，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等頻頻挑選，獲取穩(wěn)固轉(zhuǎn)染的同源細胞系。轉(zhuǎn)染效率受多種要素影響，主要要素有下邊幾個：1轉(zhuǎn)染試劑不一樣細胞系轉(zhuǎn)染效率往常不一樣，但細胞系的選擇往常是依據(jù)實驗的需要，所以在轉(zhuǎn)染實驗前應依據(jù)實驗要乞降細胞特征選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都會供給一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細胞株列表和文件，經(jīng)過這些資料可選擇最適合實驗設(shè)計的轉(zhuǎn)染試劑。自然，最適合的是高效、低毒、方便、低價的轉(zhuǎn)染試劑。2細胞狀態(tài)一般低的細胞代數(shù)（50）能保證基因型不變。最適合轉(zhuǎn)染

10、的細胞是經(jīng)過幾次傳代后達到指數(shù)生長久的細胞，細胞生長旺盛，最簡單轉(zhuǎn)染。細胞培育在實驗室中保留數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會致使和轉(zhuǎn)染有關(guān)的細胞行為的變化。也就是說同一種系的細胞株，在各實驗室不一樣培育條件下，其生物學性狀發(fā)生不一樣程度的改變，致使其轉(zhuǎn)染特征也發(fā)生變化。所以，假如發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低，能夠試著轉(zhuǎn)染新鮮培育的細胞以恢復最正確結(jié)果。3轉(zhuǎn)染方法不一樣轉(zhuǎn)染試劑有不一樣的轉(zhuǎn)染方法，但大多迥然不一樣。轉(zhuǎn)染時應跟據(jù)詳細轉(zhuǎn)染試劑介紹的方法，但也要注意，因不一樣實驗室培育的細胞性質(zhì)不一樣，質(zhì)粒定量差異，操作手法上的差異等，其轉(zhuǎn)染成效可能不一樣，應依據(jù)實驗室的詳細條件來

11、確立最正確轉(zhuǎn)染條件。（1）細胞培育物健康的細胞培育物是成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不一樣細胞有不一樣的培育基，血清和增添物。高的轉(zhuǎn)染效率需要必定的細胞密度，一般的轉(zhuǎn)染試劑都會有特意的說明。介紹在轉(zhuǎn)染前24小時分細胞，這將供給正常細胞代謝，增添對外源DNA攝取的可能。必定要防止細菌，支原體或真菌的污染。（2）細胞密度細胞密度對轉(zhuǎn)染效率有必定的影響。不一樣的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時的最適細胞密度各不同樣，即便同一種試劑，也會因不一樣的細胞種類或應用而異。轉(zhuǎn)染時過高或許過低的細胞密度會致使轉(zhuǎn)染效率降低，以致表達水平偏低。所以假如采納新的細胞系或許新的轉(zhuǎn)染試劑，最好能夠進行優(yōu)化實驗并為此后的實驗成立一個穩(wěn)固方法，包含

12、適合的接種量和培育時間等等。陽離子脂質(zhì)體擁有微量的細胞毒性而常常需要更高的鋪板密度或許更多的懸浮細胞數(shù)，有的要求細胞90%匯片；而有些多胺或許非脂質(zhì)體的配方則要求在40%-80%之間，總之是盡量在細胞最適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染，以求最正確的轉(zhuǎn)染成效。不一樣的實驗目的也會影響轉(zhuǎn)染時的鋪板密度，比方研究細胞周期有關(guān)基因等表達周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進行轉(zhuǎn)染的試劑。一般轉(zhuǎn)染時貼壁細胞密度為50%-90%，但這個需要參照所選轉(zhuǎn)染試劑的說明書。（3）血清血清一度曾被以為會降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法常常要求轉(zhuǎn)染前后洗細胞或許在無血清培育基條件下轉(zhuǎn)染，但有些對此敏感

13、的細胞如原代細胞會遇到損害，甚至死亡導致轉(zhuǎn)染效率極低。可是轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)改革后的今日，關(guān)于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在已經(jīng)不會影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提升轉(zhuǎn)染效率，如陽離子聚合物等，血清的存在會影響DNA轉(zhuǎn)染復合物的形成，但只需在DNA-轉(zhuǎn)染復合物形成時用無血清培養(yǎng)基或PBS來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑就能夠了，在轉(zhuǎn)染過程中是能夠使用血清的。可是要特別注意：關(guān)于RNA轉(zhuǎn)染，怎樣除去血清中潛伏的RNase污染是值得關(guān)注的。胎牛血清FCS）常常用到，廉價一點的有馬或牛血清。往常的，血清是一種包含生長因子及其余協(xié)助因子的不切實成分的增添物，對不一樣細胞的生長作用有很大的差異。血清質(zhì)量的變化直接影響細

14、胞生長，所以也會影響轉(zhuǎn)染效率。新加培育基的預熱對細胞轉(zhuǎn)染很有幫助。4）抗生素細胞培育過程中常常會增添抗生向來防備污染，可是這些增添劑可能對轉(zhuǎn)染造成麻煩。比方青霉素和鏈霉素，就是影響轉(zhuǎn)染的培育基增添物。這些抗生素一般關(guān)于真核細胞無毒，但有些轉(zhuǎn)染試劑增添了細胞的通透性，使抗生素能夠進入細胞。這可能間接致使細胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。當前轉(zhuǎn)染試劑由于全程都能夠用有血清和抗生素等增添劑的完整培育基來操作，特別方便，省去了污染等麻煩。（5）氮磷（N/P）比N/P比是轉(zhuǎn)染效率的重點（為了換算方便，一般以DNA/轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量比表示），在必定比率范圍內(nèi)轉(zhuǎn)染效率隨N/P比成比率增高，以后達到平值，但毒性也隨之而增

15、添，所以在實驗以前應依據(jù)介紹比率，確立本實驗的最正確轉(zhuǎn)染比率。6）DNA質(zhì)量DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響特別大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）鑒于電荷吸引原理，如DNA不純，如帶少許的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會明顯影響轉(zhuǎn)染復合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進行，但對GenEscort系列轉(zhuǎn)染試劑影響不大。核酸純化世界第一品牌德國QIAGEN企業(yè)供給的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達到兩倍2CsCl梯度離心以上的純度成效，使您不用為DNA質(zhì)量費心。別的，對一些內(nèi)毒素敏感的細胞（如原代細胞，懸浮細胞和造血細胞），QIAGEN還供給可去除內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒抽提試劑盒，在質(zhì)粒抽提過程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉(zhuǎn)染成效。

16、但假如使用GenEscort轉(zhuǎn)染試劑，一般不需要這么高的DNA質(zhì)量要求。當使用GenEscort轉(zhuǎn)染試劑時，即便采納傳統(tǒng)的酚氯仿積淀方法純化質(zhì)粒，仍舊可達到特別好的轉(zhuǎn)染成效，但所用的質(zhì)粒量比試劑盒純化方法的DNA用量大一些。4載體建立轉(zhuǎn)染載體的建立（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高，但不一樣病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細胞，別的還需考慮一些安全問題（如基因污染）。除載體建立外，載體的形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不一樣的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對剎時和穩(wěn)固轉(zhuǎn)染的影響

17、。假如基因產(chǎn)物對細胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進行，所以選擇構(gòu)成或可調(diào)控，強度適合的啟動子也很重要，同時做空載體及其余基因的同樣載體建立的轉(zhuǎn)染正比較可清除毒性影響的擾亂。轉(zhuǎn)染技術(shù)的重點及轉(zhuǎn)染試劑正確選擇轉(zhuǎn)染技術(shù)的重點及轉(zhuǎn)染試劑正確選擇轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術(shù)，它是研究基因表達調(diào)控，突變剖析等的慣例工具。跟著功能研究的盛行，其應用愈來愈寬泛。以下就向大家介紹一些轉(zhuǎn)染的技術(shù)重點及市道上主要的轉(zhuǎn)染試劑種類的選擇。慣例轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是剎時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)固轉(zhuǎn)染（永遠轉(zhuǎn)染）。前者外DNA/RNA不整合到宿主染色體中，所以一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的

18、表達，但往常只連續(xù)幾日，多用于啟動子和其余調(diào)控元件的剖析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-96小時內(nèi)（依靠于各樣不一樣的建立）剖析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩(wěn)固轉(zhuǎn)染，外源DNA既能夠整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。只管線DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大概1/104轉(zhuǎn)染細胞能整合，往常需要經(jīng)過一些選擇性標志，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等頻頻挑選，獲取穩(wěn)固轉(zhuǎn)染的同源細胞系。轉(zhuǎn)染效率收多種要素影響

19、，主要要素有下邊幾個：細胞培育物健康的細胞培育物是成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不一樣細胞有不一樣的培育基，血清和增添物。低的細胞代數(shù)（50）能保證基因型不變。高的轉(zhuǎn)染效率需要必定的細胞密度，一般的轉(zhuǎn)染試劑都會有特意的說明。介紹在轉(zhuǎn)染前24小時分細胞，這將供給正常細胞代謝，增添對外源DNA攝取的可能。必定要防止細菌，支原體或真菌的污染。血清大部分培育基在使用前需要加血清。胎牛血清（FCS）常常用到，廉價一點的有馬或牛血清。往常的，血清是一種包含生長因子及其余協(xié)助因子的不切實成分的增添物，對不一樣細胞的生長作用有很大的差異。血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。所以在轉(zhuǎn)染前建議先測(轉(zhuǎn)右)試出對細胞生長優(yōu)秀的血清批

20、號，轉(zhuǎn)染時用同一批號的血清，并同時做負對照（不加轉(zhuǎn)染試劑及外源DNA）以測試細胞生長能否正常。有些轉(zhuǎn)染技術(shù)如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在狀況下效率很低，所以在轉(zhuǎn)染前要除血清。但有些對此敏感的細胞如原代細胞會遇到損害，甚至死亡致使轉(zhuǎn)染效率極低。載體建立轉(zhuǎn)染載體的建立（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高，但不一樣病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細胞，別的還需考慮一些安全問題（如基因污染）。除載體建立外，載體的形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不一樣的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對剎時和穩(wěn)固

21、轉(zhuǎn)染的影響。假如基因產(chǎn)物對細胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進行，所以選擇構(gòu)成或可調(diào)控，強度適合的啟動子也很重要，同時做空載體及其余基因的同樣載體建立的轉(zhuǎn)染正比較可清除毒性影響的擾亂。4.DNA質(zhì)量DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響特別大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）鑒于電荷吸引原理，如DNA不純，如帶少許的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會明顯影響轉(zhuǎn)染復合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進行。核酸純化世界第一品牌德國QIAGEN企業(yè)供給的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達到兩倍2xCsCl梯度離心以上的純度成效，使您不用為DNA質(zhì)量費心。別的，對一些內(nèi)毒素敏感的細胞（如原代細胞，懸浮細胞和造血細胞），QIAGEN還供給可去除內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒抽提試劑盒，在質(zhì)粒抽提過程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉(zhuǎn)染成效。轉(zhuǎn)染技術(shù)