HGH質(zhì)量檢定實(shí)驗(yàn)

1、產(chǎn)品質(zhì)量研究對(duì)于rHGH產(chǎn)品的質(zhì)量研究貫穿整個(gè)實(shí)驗(yàn)室研究、中試研究過(guò)程，并對(duì)工藝各階段進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，確保產(chǎn)品的高質(zhì)量。對(duì)中試產(chǎn)品的質(zhì)量控制分兩方面進(jìn)行：1. 半成品/成品的質(zhì)量控制；2. 成品的質(zhì)量控制。均嚴(yán)格按照中國(guó)生物制品檢定規(guī)程（2000版）中各相關(guān)規(guī)定與程序進(jìn)行。一產(chǎn)品質(zhì)量研究半成品質(zhì)量檢定1.1免疫印跡試驗(yàn)： 用鼠抗人的HGH單克隆抗體（Neomarkers公司）對(duì)rHGH進(jìn)行western blot分析。結(jié)果見(jiàn)圖1，rHGH顯示強(qiáng)陽(yáng)性。m 1 2 3 1 2 3m 1 2 3 1 2 397kd66 kd43 kd31 k97kd66 kd43 kd31 kd20 kd14

2、kd(a) (b) 圖1. rHGH表達(dá)SDS及western-blotting圖（a）：SDS膠 （b）：Western blotting膜M: Marker ；1.2.3 HGH原液凍干品1.2紫外光譜掃描：根據(jù)中國(guó)生物制品檢定規(guī)程（2000版）中“紫外光譜測(cè)定”的具體方法進(jìn)行。將純化樣品用生理鹽水稀釋到0.5mg/ml，加入1cm石英吸收池內(nèi)，在220-300nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描樣品。圖21 批號(hào)rHGH掃描圖圖22: 20020902批號(hào)rHGH半成品掃描圖同時(shí)還掃描另外2個(gè)批號(hào)半成品，特征波長(zhǎng)如下：樣品特征峰波長(zhǎng)nm吸光值200209012790.42417200209022790.4

3、1222200209032790.43200可見(jiàn)，本產(chǎn)品蛋白質(zhì)特征峰在2773nm范圍內(nèi)1.3 純度及分子量檢測(cè)a. sds電泳：用非還原型SDS法檢測(cè)樣品的純度，還原型SDS法檢測(cè)樣品的分子量，將待檢樣品加上樣品緩沖液，加熱5分鐘，上樣，使加樣量不低于5g（銀染法）或10g（考馬氏亮藍(lán)R-250染色法），經(jīng)Pharmacia vds掃描分析。 a b c a b c a b c圖31.半成品還原、非還原SDS電泳Marker 2012011批號(hào)rHGH還原處理 2012011批號(hào)rHGH非還原處理b . 2012012批號(hào)rHGH還原處理c 2012012批號(hào)rHGH非還原處理b 20120

4、17批號(hào)rHGH還原處理c 2012017批號(hào)rHGH非還原處理掃描結(jié)果如下： 樣品名稱(chēng)主帶掃描面積分子量(Da)2012101198.5220152012101297.922204 2012101799.522125 可見(jiàn)，半成品遷移位置一致，連續(xù)3批半成品掃描純度達(dá)到95%以上，連續(xù)3批半成品分子量為22125205.92，說(shuō)明用非還原電泳檢測(cè)蛋白純度和用還原電泳檢測(cè)蛋白分子量方法可信。b. 分子量檢測(cè)：（質(zhì)譜法）使用對(duì)照品（Saizen HGH），加250l無(wú)菌PBS溶解成100g/ml，10ul分裝。將對(duì)照品與樣品做質(zhì)譜檢測(cè)，分子量均為22 125D。圖32對(duì)照品質(zhì)譜圖圖33 批號(hào)20

5、031027樣品質(zhì)譜圖c. HPLC純度分析：在方法建立之時(shí)，我們采用Saizen HGH對(duì)照品做對(duì)照，同時(shí)以原液緩沖體系做基線(xiàn)。具體方法如下：色譜條件色譜主機(jī)廠家與型號(hào)：Waters 600 486色譜柱廠家與規(guī)格：Waters C18 3.9300mm 流動(dòng)相：A: 10乙氰+0.1TFA B: 乙氰0.1TFA梯度：timeflowA%B%0110002512080301208033101003511000流速：1.0 ml/min樣品上樣濃度：標(biāo)示量為0.5mg/瓶，加純化水溶解成1mg/ml樣品上樣量：20ul檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm結(jié)果如圖：樣品純度97HGH標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜Name

6、Retention TimeArea% AreaHeightInt TypeAmountUnitsPeak TypePeak Codes122.0381254590100.0055204BBUnknownHGH原液凍干品 HPLC圖譜NameRetention TimeArea% AreaHeightInt TypeAmountUnitsPeakType Peak Codes117.872171790.70453BBUnknown220.04969661.09275BBUnknown321.61769901.301382BVUnknownI06 422.07759170797.0025451V

7、BUnknown同時(shí)研究其它2個(gè)批號(hào)半成品，其保留時(shí)間、主峰面積如下： 樣品名稱(chēng)保留時(shí)間主峰面積標(biāo)準(zhǔn)品22.0381002003101722.07797.002002090222.04597.122002090322.05698.20可見(jiàn)，對(duì)照品與樣品的主峰時(shí)間大致相同，半成品純度為97-100，本實(shí)驗(yàn)方法可以用于HGH純度測(cè)定。1.4 等電點(diǎn)測(cè)定：根據(jù)中國(guó)生物制品檢定規(guī)程（2000版）中“等電點(diǎn)測(cè)定”的第二法“等電聚焦水平板電泳”具體方法進(jìn)行。半成品用7000D截流量的透析袋在純化水中，4透析過(guò)夜，lowry法定量，隨后稀釋到0.5mg/ml 濃度，兩性電解質(zhì)為pharmacia公司pH3.

8、0-10.0，上樣量10l。硫酸銅考馬斯蘭染色。HGH pI為5.2（4.0-6.5）. 1 2 2rhGH3.504.555.205.856.556.857.358.158.458.659.3 rhGH3.504.555.205.856.556.857.358.158.458.659.3 r hGH原液等電聚焦圖1PI Marker: 從上到下PI依次為3.50、4.55、5.20、5.85、6.55、6.85、7.35、8.15、8.45、8.65、9.302原液掃描后結(jié)果如下：樣品PI200310175.2200310185.2可見(jiàn)，各批樣品在等電聚焦電泳中的遷移位置一致，PI一致，說(shuō)明

9、用此方法測(cè)定HGH等電點(diǎn)方法可信；本產(chǎn)品的等電點(diǎn)在4.0- 6.5范圍內(nèi)。1.4 相關(guān)蛋白含量測(cè)定：根據(jù)藥典，取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液20ul (取重組人生長(zhǎng)激素對(duì)照品或甲?；亟M人生長(zhǎng)激素對(duì)照品，用三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(ph 7.5)制成2mg/ml，加過(guò)氧化氫溶液使終濃度為0.01ml/ml),4放置5小時(shí)后，每1 ml加入4.5mg 的L-甲硫氨酸），注入HPLC。色譜主機(jī)：Waters 600 Waters TM486 MILLENNIUM32色譜柱：5um, 4.6mm*150mm C4分析柱流動(dòng)相 A：0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（PH7.5）流動(dòng)相 B：正丙醇

10、 色譜純(Fisher A-414-4)梯度： timeflowB%A%00.50100200.52971500.58020流速：0.5ml/min樣品濃度： 1mg/ml樣品上樣量： 20ul檢測(cè)波長(zhǎng)：220nmHGH發(fā)酵液HPLC圖譜NameRetention TimeArea% AreaHeightInt TypeAmountUnitsPeak Type Peak Codes1 0.304 2509589 0.72 289171BV Unknown20.621104347633.00613877VVUnknown30.976170897994.92682987VVUnknown41.49

11、4113000803.25644123VVUnknown51.719182603585.261003383VVUnknown61.900136836193.94828503VBUnknownI06 712.25016123150.4610530BBUnknownI08 819.699107764473.10121714BVUnknown919.9008242270.24119585VVUnknownI06 1020.92374027782.13161335VVUnknown1122.415239781006.90308462VVUnknown1222.63353008491.53303552V

12、VUnknownI06 1322.996201644515.81289942VVUnknown1424.902172378764.96396934VVUnknown1526.3028502070.2446819VVUnknown1626.86320860400.6055520VVUnknown1727.39432412040.93115146VVUnknown1828.16722682720.6576761VVUnknownI08 1928.61836231661.0485065VVUnknown2029.61536276571.0485441VVUnknown2133.34079854908

13、22.99852771VVUnknown2233.8123613777610.40880548VVUnknown2334.40074848072.16530730VVUnknownI06 2434.705148811094.28473269VVUnknown2535.534217658726.27286527VVUnknown2637.40319553450.56100350VVUnknown2737.70359718771.7292508VVUnknown2839.51412170750.3534583VVUnknown2940.31312584710.3640083VVUnknown304

14、0.9003231170.0914087VVUnknownI06 3141.433676860.027620VVUnknownI06 3241.7171268350.046528VBUnknownI08 3343.3671870.0029BBUnknownI08 HGH標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC 圖譜NameRetention TimeArea% AreaHeightInt TypeAmountUnitsPeakType PeakCodes1Peak133.1186290337579.251594087BVFoundQ20 2Peak234.10748039036.05222709VVFoundQ20

15、3Peak334.50762621157.89173893VVFoundQ20 4Peak435.60551747726.5281626VBFoundQ20 5Peak539.06737860.00148BBFoundI08 Q20 6Peak640.167922650.122176BBFoundI08 Q20 7Peak746.750943140.123475BVFoundI08 Q20 8Peak847.333425170.051919VBFoundI08 Q20 圖5 HGH標(biāo)準(zhǔn)品+ H2O2 HPLC 圖譜NameRetention TimeArea% AreaHeightInt Ty

16、peAmountUnitsPeak TypePeak Codes1Peak121.33356243266.1746937BBFound I08 Q20 2Peak225.4671515498416.6368691BVFoundI08 Q20 3Peak327.70076518248.4058680VVFoundI08 Q20 4Peak431.5256267740668.78534321VBFoundQ20 5Peak5 37.48329590.00194BVFoundI08Q20 6Peak637.51714030.00184VBFoundI06Q20 7Peak738.0001880.0026BBFoundI08Q20 8Peak838.617181040.02719BVFoundI08Q20 9 Peak939.117498