螺旋藻激酶對大鼠動靜脈環(huán)路血栓的溶栓作用研究

1、螺旋藻激酶對大鼠動靜脈環(huán)路血栓的溶栓作用研究王保斌，張崔勇，黃家俍，劉慶，朱召熊，安明，蒙蓮【摘要】目的探究螺旋藻激酶(SPK)對大鼠動靜脈環(huán)路血栓的溶栓作用及其機制。方法采用大鼠頸動-靜脈環(huán)路血栓模型,通過稱取血栓重量來測定螺旋藻激酶的溶栓作用;腹主動脈取血別離血漿，測定螺旋藻激酶對血漿D二聚體、TPA含量的影響。結果螺旋藻激酶使動靜脈環(huán)路血栓干、濕重明顯減輕，高、低劑量螺旋藻激酶使血漿D-二聚體含量明顯升高(P均0.05)，高劑量螺旋藻激酶使TPA含量明顯升高(P0.05)。結論螺旋藻蛋白激酶能抑制血栓形成,激活纖溶活性,具有較好溶栓效力?！娟P鍵詞】螺旋藻蛋白激酶;頸動靜脈血栓形成;血栓溶

2、解血栓性疾病是臨床常見病，嚴重地危害人們的安康，尋找具有抗凝和溶栓作用的物質對防治血栓性疾病具有廣泛的臨床實用價值。螺旋藻(Spirulina)是一種水生植物,廣泛分布于中國廣西、福建、浙江、云南、海南等省區(qū)，具有增強免疫力、抗輻射、抗疲勞等藥理作用，它如今已經(jīng)被開發(fā)出具有多種成效的天然綠色保健品1。我們首先從螺旋藻的發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)一種具有溶解纖維蛋白作用的蛋白激酶類活性成分，我們稱它為螺旋藻激酶(SPK)，本試驗主要使用螺旋藻激酶提取液觀察它對大鼠動靜脈環(huán)路血栓的溶栓作用及其溶栓機制，為開發(fā)廉價有效的治療血栓性疾病的藥物提供實驗根據(jù)。1器材與方法1.1藥品與試劑肝素鈉注射液(天津市生物化學制藥

3、廠061226);纖維蛋白原凍干粉(24g廣西醫(yī)科大學實驗中心蛇毒所研制)、凝血酶(由中國藥品生物制品所提供),TPA含量測定試劑盒(上海太陽生物技術公司)，尿激酶(麗珠集團麗珠制藥廠，批號國藥準字H44020645，產品批號060701),其他均為國產分析純。1.2SPK粗酶提取物的制備按照螺旋藻激酶粉由北海市康福保健食品提供，經(jīng)廣西測試中心檢測其蛋白激酶含量為6000FU(活力單位)/g10g粉劑溶于100l生理鹽水的比例混勻，以3000r/in離心10in，取一定體積上清液攪拌參加飽和硫酸銨溶液，然后以8000r/in低溫離心20in后，依次分別獲得015%，15%35%，35%45%，

4、45%55%，55%65%，65%75%飽和度的蛋白質沉淀，用三蒸水溶解，倒入透析袋，置于冰箱中進展透析，除去硫酸銨，然后置于低溫冷凍枯燥機中枯燥得各段鹽析產物的粉劑。取各段鹽析產物在瓊脂糖-纖維蛋白平板上進展溶圈實驗，取纖溶活性高的部分為SPK提取物。1.3動物與儀器istar大鼠，雌雄不拘,體質量300350g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。動物合格證號桂動許字(2000)第001號。主要儀器：電熱恒溫水浴箱(姜堰市天力醫(yī)療器械消費);電熱恒溫枯燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠，型號：G2X-DH-40*4.5-BS);電子分析天平(sartrius公司消費，型號：BP190S81136606)

5、;TDL25臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)。2方法2.1大鼠動靜脈環(huán)路血栓模型的制備及給藥istar大鼠40只，隨機分為4組，每組10只，即SPK高劑量組(1g/l)、低劑量組(0.3g/l)，生理鹽水陰性對照組及尿激酶陽性對照組(2000l/l)，大鼠以20%氨基甲酸乙酯0.5l/100g腹腔麻醉，由股靜脈按0.5l/100g推藥，參照文獻制作動靜脈環(huán)路血栓模型，別離右側頸總動脈及左側頸外靜脈，并將兩根用肝素生理鹽水(25U/l)處理的聚乙烯管分別插入頸總動脈及頸外靜脈，在動-靜脈旁路的連接收內插入一段長8的鋼絲，用藥后40in開放動脈靜脈環(huán)路15in，中斷血流形成血栓2，3。2.2動靜脈

6、環(huán)路血栓測定用藥后40in開放動脈靜脈環(huán)路15in，中斷血流形成血栓后迅速取出包裹鋼絲的血栓稱重，并減去鋼絲重量，即得血栓濕重，并求出其血栓抑制率。在70枯燥箱中1h后，待其冷卻后稱取干重，求出血栓抑制率2。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.2.3血漿D二聚體和TPA含量的測定腹主動脈取血及別離得到血漿，在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科測定D二聚體含量，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血漿TPA的含量。2.4統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)處理所測數(shù)據(jù)由作者采用SPSS10.0軟件經(jīng)計算機處理,統(tǒng)計結果以s表示,組間差異顯著性用t檢驗斷定。3結果3.1SPK對大鼠動靜脈環(huán)路血栓形成重量的影響結果顯示，SPK有抑制動靜

7、脈環(huán)路血栓形成的作用，使血栓形成的濕重及干重明顯減輕，與對照組比擬有顯著性差異，且呈量效依賴關系。結果見表1。表1SPK對大鼠動靜脈環(huán)路血栓形成重量的影響與生理鹽水組比擬，*P0.05;n=103.2SPK對大鼠血漿D二聚體和TPA的含量的影響結果顯示，高、低劑量SPK均使D二聚體含量顯著增加，高劑量SPK使TPA含量顯著增加，且從數(shù)值上看，有劑量效應依賴關系。結果見表2。表2SPK對大鼠D二聚體和TPA的含量的影響4討論螺旋藻激酶(SPK)是利用液體發(fā)酵的技術從螺旋藻消費出的蛋白酶，前期我們研究發(fā)現(xiàn)SPK有較高的溶栓活性。本實驗我們驗證其體內溶栓活性，實驗結果說明SPK可抑制動靜脈環(huán)路血栓，

8、使血栓形成的濕重及干重明顯減輕，與對照組比擬有顯著性差異，且呈量效依賴關系。血栓是血液中纖維蛋白多聚體與細胞組成的復合物，血栓溶解的中心環(huán)節(jié)在于纖維蛋白的溶解。纖維蛋白溶解分為兩個根本階段，第一階段：纖溶酶原被纖溶酶原激活物激活為纖溶酶。纖溶酶原激活物(TPA)是內皮細胞合成的一種絲氨酸蛋白酶，在血栓形成時，TPA與纖維蛋白原形成復合物后在部分有效地激活纖溶酶原轉化為纖溶酶而使血栓溶解4。本實驗中，大鼠注射SPK溶液后，血漿TPA含量增加，且隨著用藥劑量的增加，其含量有遞增趨勢，說明SPK可以通過促進內皮細胞合成分泌TPA來促進纖溶作用;第二階段：纖溶酶分解纖維蛋白和纖維蛋白原為許多可溶性的小

9、肽，稱為纖維蛋白降解產物，而D二聚體為交聯(lián)纖維蛋白降解的特異性分子標記物，為降解產物中的最小片段，是血栓被溶解的直接證據(jù)4,5。本實驗制作大鼠動靜脈環(huán)路血栓模型，大鼠注射SPK溶液后，血漿D二聚體含量明顯增加，且隨著用藥劑量的增加有遞增趨勢，說明SPK可使血液系統(tǒng)的纖溶活性增強，使纖維蛋白溶解，特異性降解產物增多。綜上所述SPK具有溶栓作用,但其溶栓作用的機制有待進一步研究，同時由于提取工藝不成熟,產品成分復雜，純度低，作用效果尚不夠穩(wěn)定，也有待今后我們進一步進展別離提純，為開發(fā)價格更低、作用更顯著，副作用更少更平安的新型溶栓藥物提供了實驗與理論聯(lián)絡實際根據(jù)?！緟⒖嘉墨I】1秦文敏,田永云.螺旋藻的藥理研究進展J.實用醫(yī)技雜志,2022,14(20):2830.2陳奇.中藥藥理研究方法學.北京：人民衛(wèi)生出版社,1994:571.3陳洲，黃自強，許建華，等.葡萄球菌激酶對大鼠頸動脈血栓的溶栓作用J.血管康復醫(yī)學雜志，2022,15(1):33.4汪世華，胡開輝，沙莉，等.溶栓酶的研究與開發(fā)J