活血健腦膠囊對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用

1、活血健腦膠囊對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用【關(guān)鍵詞】活血健腦膠囊/藥理學(xué)；腦缺血/中藥療法；腦組織/病理學(xué)；細(xì)胞凋亡；疾病模型，動(dòng)物；大鼠1材料與方法1.1動(dòng)物與藥物SD大鼠78只，體質(zhì)量300350g，鼠齡56月齡，雌雄各半，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供合格證號(hào)：0001475?；钛∧X膠囊由上海復(fù)星臨西制藥提供批號(hào)：202200306；尼達(dá)爾片尼莫地平，20g/片，由天津市中央藥業(yè)消費(fèi)批號(hào)：020602；9g/L的氯化鈉注射液由北京雙鶴藥業(yè)提供(批號(hào):030312312)。1.2試劑與儀器Keyrds：SINENINE/pharalgy;ARTHRITIS,RHEUATID/TD

2、therapy;1.3分組與給藥將78只大鼠按隨機(jī)法分為假手術(shù)組6只，模型組、尼莫地平組、活血健腦膠囊組各24只，后3組再分為缺血2h及再灌注后6、12、24h組，每組6只。于造模前3d，尼莫地平組灌胃給予尼莫地平10.8gkg1d1，活血健腦膠囊組灌胃給予活血健腦膠囊混懸液1.8gkg1d1，假手術(shù)組、模型組灌胃生理鹽水，均每天1次,共3d，各組最后1次給藥2h后造模，造模成功后2h拔出栓線進(jìn)展再灌注，于再灌注后6、12、24h取材。1.4造模方法所有大鼠均按Lnga【】的方法栓塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈,將單股尼龍線的頭端0.5熱膨脹并打磨后，經(jīng)頸外動(dòng)脈-頸總動(dòng)脈-頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入大腦中動(dòng)脈起始部位，造

3、成栓塞，于栓塞2h拔出栓線，形成缺血后再灌注，再灌注時(shí)間分別為6、12、24h。1.5指標(biāo)與檢測(cè)方法在2010倍的光鏡視野下，對(duì)yt染色陽性細(xì)胞進(jìn)展統(tǒng)計(jì)，顯微鏡下胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞。采用彩色病理圖文分析系統(tǒng)，測(cè)量yt染色陽性細(xì)胞的灰度值，以各測(cè)量點(diǎn)的灰度值減去相應(yīng)背景灰度值后的平均值為各區(qū)的平均灰度值。每張切片中采集3個(gè)具有代表性的高倍視野，視野中細(xì)胞總數(shù)不少于100個(gè),主要統(tǒng)計(jì)半暗帶區(qū)及海馬區(qū)的表達(dá)情況,對(duì)于缺血區(qū)的變化僅作形態(tài)學(xué)觀察,未作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.0Frinds軟件包進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1病理形態(tài)假手術(shù)組腦組織構(gòu)造

4、正常，無明顯水腫；模型組HE染色缺血損傷累及廣泛皮層及紋狀體外側(cè)，缺血中心區(qū)與周圍區(qū)界限不易區(qū)分，神經(jīng)元壞死、變性，胞漿嗜酸，胞核溶解，細(xì)胞周邊呈扇形空泡改變，堵塞中心區(qū)可見細(xì)胞壞死，局部細(xì)胞消失，可見微血管、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。尼莫地平組及活血健腦膠囊組腦組織病理改變較輕，可見神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞呈輕度的腫脹，個(gè)別神經(jīng)元呈變性改變圖1。電鏡下見假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞體積大，細(xì)胞質(zhì)豐富，可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微絲、細(xì)胞核大，呈圓形或橢圓形，有13個(gè)；常染色質(zhì)豐富，異染色質(zhì)較少，可見線粒體細(xì)微腫脹現(xiàn)象。模型組神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞體固縮或腫脹；細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)凝集成塊或溶解，異染色質(zhì)邊集，核膜連續(xù)性破壞或凹陷

5、，核固縮或溶解壞死；許多線粒體腫脹成空泡狀，嵴模糊、斷裂、消失，線粒體內(nèi)基質(zhì)電子密度降低，整個(gè)細(xì)胞漿呈空化狀態(tài)。尼莫地平組可見核輕度不規(guī)那么，核膜完好，異染色質(zhì)邊集現(xiàn)象少見；異形線粒體較少，多數(shù)線粒體嵴清楚、連續(xù)?；钛∧X膠囊組神經(jīng)元線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹,線粒體嵴幾乎正常，有34個(gè)初級(jí)溶酶體，1個(gè)次級(jí)溶酶體，細(xì)胞核根本正常，可見大而明顯的核仁，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞器量較大，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及游離的核糖體量較多，可見較多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞圖2。2.2yt蛋白表達(dá)假手術(shù)組僅見yt蛋白弱陽性表達(dá)；模型組大鼠腦缺血再灌注2h后yt蛋白開場(chǎng)表達(dá)，再灌注6h表達(dá)量達(dá)頂峰，再灌注12h表達(dá)量下降，再灌注24h降至最低點(diǎn)

6、。再灌注24h內(nèi)yt的表達(dá)區(qū)域主要集中在海馬錐體細(xì)胞和齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞。活血健腦膠囊治療組腦缺血/再灌注6hyt陽性表達(dá)較弱,與模型組比擬有顯著性差異(P0.01),尼莫地平組腦缺血/再灌注12、24hyt陽性表達(dá)與模型組及假手術(shù)組比擬均無顯著性差異(P0.05)。尼莫地平組腦缺血/再灌注6、12、24hyt陽性表達(dá)與模型組比擬均無顯著性差異(P0.05)。結(jié)果見表1、圖3。a.假手術(shù)組b.模型組.活血健腦膠囊組d.尼莫地平組圖1各組腦組織病理形態(tài)比擬HE染色，200Figure1Pathlgialfeaturesfbraintissueindifferentgrups(byHEstainin

7、g,200)a.假手術(shù)組b.模型組.活血健腦膠囊組d.尼莫地平組圖2各組神經(jīng)元超微構(gòu)造比擬20000Figure2parisnfneurnultrastrutureindifferentgrups(20000)3討論a.假手術(shù)組b.模型組.活血健腦膠囊組d.尼莫地平組圖3各組yt表達(dá)比擬免疫組化，200Figure3parisnfytexpressinindifferentgrups(byiunhistheistry,200)本實(shí)驗(yàn)?zāi)X缺血再灌注24h組海馬神經(jīng)元損傷較重,從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核均發(fā)生了嚴(yán)重變化,甚至壞死。隨著缺血再灌注時(shí)程的增加，線粒體數(shù)目減少且明顯腫脹,同時(shí),嵴膜外表密度明顯減少。應(yīng)用活血健腦膠囊治療后，海馬神經(jīng)元的損傷較輕,細(xì)胞的超微構(gòu)造根本正常。而腦缺血2h后再灌注6h至12h未用活血健腦膠囊治療者那么神經(jīng)元超微構(gòu)造有一定程度的損傷,可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張并脫顆粒，核糖體和脂褐素顆粒增多，線粒體腫脹,細(xì)胞核周間隙稍增寬，異染色質(zhì)稍增多，異染色質(zhì)邊聚,說明活血健腦膠囊對(duì)腦缺血后神經(jīng)元損傷具有一定修復(fù)作用,特別是對(duì)線粒體的保護(hù)作用較明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素蛋白在缺血2h后再灌注6h的表達(dá)主要在海馬A2區(qū)和齒狀回區(qū)。這一結(jié)果驗(yàn)證了腦缺血再灌