維拉帕米誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)鈣變化

1、維拉帕米誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)鈣變化【摘要】目的：討論鈣通道拮抗劑維拉帕米verapail，Ver對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮huanretinalpigentepitheliu,hRPE細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用及凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)鈣濃度a2+i的變化。方法：應(yīng)用80g/L的Ver作用體外培養(yǎng)hRPE細(xì)胞12，24及48h，采用吖叮橙A熒光染色法、透射電鏡、流式細(xì)胞術(shù)觀察hRPE細(xì)胞凋亡；Flu-3/A負(fù)載技術(shù)，觀察凋亡過程中細(xì)胞a2+i的變化。結(jié)果：一定濃度Ver可誘導(dǎo)hRPE細(xì)胞凋亡，熒光顯微鏡及電鏡觀察hRPE細(xì)胞具有早期凋亡特征：核熒光呈黃綠色，電鏡下核染色質(zhì)濃染、邊集。流式細(xì)胞術(shù)

2、顯示，Ver作用后的hRPE細(xì)胞凋亡百分率增加F12.3415，P0.05。Ver作用的hRPE細(xì)胞內(nèi)鈣濃度a2+i呈下降趨勢(shì)F23.607，P0.01。結(jié)論：Ver能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的hRPE細(xì)胞凋亡，細(xì)胞內(nèi)a2+i濃度的變化可能是誘導(dǎo)hRPE凋亡的機(jī)制之一?！娟P(guān)鍵詞】視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞0引言增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變prliferativevitreretinpathy，PVR是孔源性視網(wǎng)膜脫離的常見并發(fā)癥和手術(shù)失敗的主要原因，盡管玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)技術(shù)不斷進(jìn)步，但復(fù)發(fā)率并未改善1，同時(shí)玻璃體切割手術(shù)本身就是誘導(dǎo)PVR形成的一個(gè)危險(xiǎn)因素2。RPE細(xì)胞的遷移、增殖可啟動(dòng)PVR的形成，而細(xì)胞內(nèi)a2+的升

3、高是RPE細(xì)胞增殖的危險(xiǎn)因素3。Ver是一種可靠的慢鈣通道阻滯劑，能阻止細(xì)胞外鈣內(nèi)流，在PVR發(fā)生中對(duì)RPE細(xì)胞增殖起著重要調(diào)節(jié)作用4。本研究應(yīng)用一定濃度鈣通道阻斷劑Ver，作用于體外培養(yǎng)hRPE細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡并觀察凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)a2+i的變化。1材料和方法1.1材料流式細(xì)胞儀B.D公司，DIAGNSTIINSTRUENTS-SPTINSIGH熒光攝像USA系統(tǒng)及etaFlu4.5/lsnapfx/IX70細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光成像USA測(cè)定系統(tǒng)。DE培養(yǎng)基(Gib)、新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(1250Dif，Gib)、維拉帕米verapail，Ver、二甲基亞砜DS

4、、吖叮橙A、A23187均為美國(guó)Siga公司產(chǎn)品；Flu-3/A熒光探針Eugeneregn,USA；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。采用胰蛋白酶消化法5。在無菌狀態(tài)下，取角膜移植后的供體眼球供體年齡限制2438歲，在無菌PBS液中沿角鞏膜緣后2處環(huán)形剪開，棄去眼前節(jié)及玻璃體，自視盤處別離視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，參加2.5g/L胰酶消化混合液，于37消化1h，參加含200L/L新生牛血清DE的培養(yǎng)液，用吸管吹打RPE細(xì)胞面使細(xì)胞脫落，將含RPE細(xì)胞的液體移入離心管中，離心1000r/in8in，棄上清后，參加培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度1105/L，將RPE細(xì)胞懸液接種于6孔板內(nèi)，37，50L/L2孵箱中培養(yǎng)。RP

5、E傳代培養(yǎng)同文獻(xiàn)6，36代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。1.2方法將第3代的hRPE細(xì)胞種植于內(nèi)置蓋玻片的24孔板中，參加Ver80g/L，作用12，24，48h后，取出玻片，與未加藥的對(duì)照組，投入950L/L乙醇中固定30in，微干，10L/L醋酸作用30s，110-4吖啶橙A染色1in，0.1l/L氯化鈣處理2in。PBS漂洗3次。且用PBS封片，熒光顯微鏡下直接觀察，每孔重復(fù)3次。在4條件下離心，搜集80g/LVer作用12，24，48h后及未加藥的hRPE細(xì)胞5106個(gè)/L，參加等量25g/L戊二醛固定，離心5in，棄去上清，移至離心管中，參加25g/L戊二醛固定，4作用30in。常規(guī)電鏡固定包埋，

6、檸檬酸鉛染色，透射電鏡上觀察，攝片。以80g/L濃度的Ver，作用12，24，48h后，搜集2106/L個(gè)細(xì)胞，離心1000r/in5in，PBS漂洗1次。離心去PBS，參加PI染液0.5L，4避光作用30in。熒光染色劑PI用氬離子激發(fā)熒光，激光發(fā)光波長(zhǎng)488n，流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)，ellquest分析軟件分析，通過計(jì)算凋亡區(qū)亞二倍體區(qū)細(xì)胞數(shù)量得出凋亡率。每個(gè)樣本重復(fù)3次。將1105/L細(xì)胞接種于3.52的一次性培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞80%交融后，參加終濃度80g/L的Ver，作用12，24，48h，換液后，參加無血清DE液體1L，參加終濃度10l/LFLU-3/A染色，37，50L/L2孵箱內(nèi)孵

7、育45in，PBS充分洗去染料，室溫靜置15in后，置于etaFlu4.5/lsnapfx/IX70細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光成像測(cè)定系統(tǒng)操作臺(tái)上，25測(cè)定單個(gè)細(xì)胞鈣熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488n，40倍物鏡觀察，每組計(jì)算20個(gè)單個(gè)細(xì)胞鈣離子濃度，取其均值。參加A231875l測(cè)定最高熒光強(qiáng)度值，參加0.2lnl2測(cè)定最低熒光強(qiáng)度值，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度按a2+iKdFax-F/F-Fin公式計(jì)算，Kd400，F(xiàn)ax為最強(qiáng)熒光值，F(xiàn)in為最低熒光值，F(xiàn)為測(cè)得細(xì)胞熒光值。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用方差分析進(jìn)展統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)過程均用SPSS10.0軟件進(jìn)展，數(shù)據(jù)用xs表示。2結(jié)果2.1A染色結(jié)果在熒光顯微鏡下，未加藥組A染色的

8、HRPE細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞質(zhì)呈紅色熒光，細(xì)胞核呈綠色均勻熒光，可見深染細(xì)胞核核仁圖1。經(jīng)80g/LVer作用后，可見凋亡細(xì)胞呈圓形，體積明顯縮小，細(xì)胞核內(nèi)可見致密濃染的黃色熒光圖2。Ver作用48h后的凋亡細(xì)胞數(shù)量比24h的明顯增多，貼壁細(xì)胞明顯減少。而作用12h的細(xì)胞與未加藥組細(xì)胞比擬無明顯變化。圖1正常hRPE細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞質(zhì)呈紅色熒光，細(xì)胞核呈綠色均勻熒光，可見深染細(xì)胞核核仁A200圖2Ver作用hRPE細(xì)胞48h，細(xì)胞呈圓形，體積明顯縮小，細(xì)胞核內(nèi)可見致密濃染的黃色熒光A2002.2透射電鏡結(jié)果正常hRPE細(xì)胞超微構(gòu)造見細(xì)胞核膜完好，染色質(zhì)均勻分布。Ver作用12h后，細(xì)胞超微構(gòu)造與未

9、加藥組無明顯差異。作用24h時(shí)凋亡的細(xì)胞在電鏡下可見：細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)染色質(zhì)邊集及染色體固縮，電子密度增強(qiáng)，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞漿濃縮，其內(nèi)細(xì)胞器保存較好，細(xì)胞漿內(nèi)可見空泡增多，細(xì)胞膜保存完好，可見細(xì)胞膜芽生出泡現(xiàn)象。48h時(shí)可見核染色質(zhì)濃縮和細(xì)胞膜芽生出泡圖3。圖3Ver作用48h的HRPE細(xì)胞，電子密度增強(qiáng)，核膜凹陷，染色質(zhì)濃縮，邊集TE67002.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Ver作用12h時(shí)，G0/G1期前可亞二倍體峰，24，48h亞二倍體峰逐漸增高。根據(jù)流式細(xì)胞儀顯示G0/G1期前的亞二倍體區(qū)所占百分率計(jì)算凋亡率，Ver作用12，24，48h的凋亡率%分別為8.211.20，16.144.60，2

10、3.933.63，組間比擬，差異有顯著性意義F12.3415，P0.05,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率逐漸增加。2.4hRPE細(xì)胞a2+i變化熒光圖像顯示，正常HRPE細(xì)胞顯示a2+熒光分布，胞核熒光最強(qiáng)，胞質(zhì)次之圖4，5。Ver可降低hRPE細(xì)胞內(nèi)a2+i,正常hRPE細(xì)胞及Ver作用hRPE細(xì)胞12，24，48h時(shí)細(xì)胞內(nèi)a2+inl/L分別為197.2529.03、176.0925.88，156.4520.60，135.2821.18，組間比擬，具有顯著性差異F23.607，P0.01)。圖4正常HRPE細(xì)胞鈣熒光，見細(xì)胞內(nèi)鈣熒光，胞核熒光強(qiáng)，胞核次之Flu-3/A400圖5A-分別為Ver作用

11、12，24，48h時(shí)hRPE細(xì)胞鈣熒光像，可見鈣熒光強(qiáng)度逐漸減弱Flu-3/A4003討論研究認(rèn)為，PVR是眼組織對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)反響的一種過度增殖的結(jié)果，其根本病理過程是原發(fā)性視網(wǎng)膜脫離或眼球穿通傷后的炎癥反響，宿主細(xì)胞的游走、增生、膜形成，增生膜與視網(wǎng)膜粘連和收縮，形成對(duì)視網(wǎng)膜的牽拉，引起牽拉性視網(wǎng)膜脫離。細(xì)胞遷移、增殖、收縮是形成PVR的關(guān)鍵病理過程，抑制這些病理過程的開展可防止PVR的形成。a2+作為細(xì)胞的第二信使及細(xì)胞增殖的啟動(dòng)因子，其濃度的變化對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及有絲分裂具有調(diào)控作用，同時(shí)第二信使a2+的變化是PVR發(fā)病機(jī)制之一7。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)降低細(xì)胞內(nèi)a2+濃度可抑制RPE細(xì)胞增殖8，我們的前

12、期工作已證明hRPE細(xì)胞冷凍后細(xì)胞內(nèi)a2+濃度明顯增高，因此推測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離a2+濃度的增高可能是hRPE細(xì)胞遷移和增殖的機(jī)制之一9,10。我們應(yīng)用80g/LVer作用體外培養(yǎng)的hRPE細(xì)胞，A熒光染色、透射電鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，可見典型的凋亡改變，而且隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡百分比逐漸增高，說明一定濃度Ver可誘導(dǎo)hRPE細(xì)胞凋亡。同時(shí)為研究hRPE細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)a2+i關(guān)系，應(yīng)用Flu-3/A熒光探針測(cè)定凋亡過程中hRPE細(xì)胞內(nèi)a2+i的變化。Flu-3/A是新一代鈣離子熒光染料，它在可見光譜激發(fā)，激發(fā)波長(zhǎng)488n，因此減少了需紫外光作激發(fā)時(shí)對(duì)活細(xì)胞的光損傷，其與a2+結(jié)合式的熒光強(qiáng)度較

13、游離形式高40100倍。因此防止了自發(fā)熒光的干擾。Flu-3與a2+親和力低，容易解離，合適測(cè)定細(xì)胞內(nèi)a2+的快速、微量變化。Rsenthal等11在培養(yǎng)不同物種的RPE細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，RPE細(xì)胞膜上存在電壓依賴a2+通道，而且這種離子通道為典型的L型通道，Hipens等12在培養(yǎng)hRPE細(xì)胞時(shí)討論a2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，認(rèn)為RPE細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞膜之間均有a2+流的改變，hRPE細(xì)胞這種典型的L型通道對(duì)Ver敏感。結(jié)合本研究結(jié)果，Ver阻斷了hRPE細(xì)胞的L型通道，降低細(xì)胞內(nèi)a2+i，引起細(xì)胞內(nèi)鈣平衡破壞，進(jìn)而誘導(dǎo)hRPE細(xì)胞凋亡。a2+i的變化可能是hRPE凋亡的關(guān)鍵信號(hào)，同時(shí)凋亡的產(chǎn)生也可能涉及其他

14、信號(hào)系統(tǒng)，尚待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來證明。Ver是一種可靠的慢鈣通道阻滯劑，降低細(xì)胞內(nèi)a2+i，而且抑制體外培養(yǎng)hRPE細(xì)胞增殖13。本研究選用Ver作用體外培養(yǎng)的hRPE細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ver能誘導(dǎo)hRPE細(xì)胞凋亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)a2+i的變化可能是hRPE細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)。如能將此藥物應(yīng)用擴(kuò)展到誘導(dǎo)凋亡，且作用于眼內(nèi)RPE細(xì)胞，具有較好的開展前途?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1inihan,TannerV,illiasnTH.Priaryrhegatgenusretinaldetahent:20yearsfhange.BrJphthall,2001;85(5):546-5482aphiarPA.Pathgeniehan

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