食品營養(yǎng)強化劑 低聚半乳糖標準文本（食品安全國家標準）

1、 PAGE PAGE 16食品安全國家標準食品營養(yǎng)強化劑 低聚半乳糖范圍本標準適用于以乳糖為原料，經(jīng)環(huán)狀芽孢桿菌及GB 2760批準使用的菌種生產(chǎn)的-半乳糖苷酶催化水解半乳糖苷鍵，將乳糖水解成為半乳糖和葡萄糖，同時通過轉(zhuǎn)移半乳糖苷的作用，將水解下來的半乳糖苷轉(zhuǎn)移到乳糖分子，生成的食品營養(yǎng)強化劑低聚半乳糖。結(jié)構(gòu)式、分子式和相對分子質(zhì)量結(jié)構(gòu)式分子式（C6H11O5）n，n為28。相對分子質(zhì)量3002000（按2007年國際相對原子質(zhì)量）產(chǎn)品分類按形態(tài)分為：低聚半乳糖粉低聚半乳糖液的直接干燥產(chǎn)品。低聚半乳糖液低聚半乳糖的液體產(chǎn)品。技術要求感官要求：應符合表1的規(guī)定。感官要求項 目指 標檢驗方法粉末液

2、體色澤與狀態(tài)白色或微黃色粉末淡黃色至黃色黏稠液體取適量試樣置于清潔、干燥的白瓷盤或燒杯中，在自然光線下，觀察其色澤和狀態(tài)，并嗅（品）其味氣味無異味無異味滋味味甜味甜理化指標：應符合表2的規(guī)定。項 目指 標檢驗方法粉末液體低聚半乳糖含量（以干基計），w/%5757附錄A中 A.2乳糖含量（以干基計），w/%2323附錄A中 A.3葡萄糖含量（以干基計），w/%2222附錄A中 A.4可溶性固形物含量，w/%73附錄A中 A.5水分，w/%5.0GB 5009.3 直接干燥法a 硫酸灰分，w/%0.30.3附錄A中 A.6pH2.85.5附錄A中 A.7鉛（以Pb計）/（mg/kg） 0.50.5

3、GB 5009.12a 取樣量1g，精確至0.1mg；干燥溫度和時間分別為105 2 和3 h。注：商品化的低聚半乳糖產(chǎn)品應以符合本標準的低聚半乳糖為原料，可添加符合質(zhì)量規(guī)格標準要求的麥芽糊精、乳清蛋白粉制成的產(chǎn)品。理化指標微生物指標：應符合表3的規(guī)定。項 目指 標檢驗方法菌落總數(shù)/（CFU /g）3000GB 4789.2大腸菌群MPN/g（mL）3.0GB 4789.3霉菌/（CFU /g）50GB 4789.15 酵母菌/（CFU /g）50GB 4789.15凝固酶陽性的葡萄球菌（1g）不得檢出SN/T 2154沙門氏菌未檢出/25 gGB 4789.4微生物指標檢驗方法一般規(guī)定本標準

4、所用試劑和水，在沒有注明其他要求時，均指分析純試劑和GB/T 6682-2008中規(guī)定的三級水。試驗中所用標準滴定溶液、雜質(zhì)測定用標準溶液、制劑及制品，在沒有注明其他要求時，均按GB/T 601、GB/T 602、GB/T 603的規(guī)定制備。試驗中所用溶液在未注明用何種溶劑配制時，均指水溶液。低聚半乳糖含量的測定 高效液相色譜雙柱法方法提要試樣用水提取后，分別利用鈣型陽離子交換柱、氨基柱分離，高效液相色譜-示差檢測器測定，面積歸一化法進行定量。試劑和材料 除另有說明外，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。乙腈：色譜純。半乳糖、葡萄糖、乳糖、低聚半乳糖三糖、低聚半乳糖四糖、低

5、聚半乳糖五糖、低聚半乳糖六糖、低聚半乳糖七糖、低聚半乳糖八糖混合溶液（20 mg/mL）。分別稱取適量的半乳糖、葡萄糖、乳糖、低聚半乳糖三糖、低聚半乳糖四糖、低聚半乳糖五糖、低聚半乳糖六糖標樣，用適量的水溶解，配制成20 mg/mL的各標準溶液。半乳糖二糖、 乳糖、異乳糖混合溶液（20 mg/mL）。稱取適量的半乳糖二糖、乳糖、異乳糖標樣，用適量的水溶解，配制成20 mg/mL的各標準溶液。儀器和設備高效液相色譜儀，帶示差檢測器。超聲清洗器。分析步驟試樣液的制備稱取試樣1.0 g，加適量的水溶解，于超聲波振蕩器中振蕩10 min，用水定容至100 mL刻度，混勻，0.2 m微孔濾膜過濾，用于鈣

6、型陽離子交換柱測定；稱取試樣5.0 g，加適量的水溶解，于超聲波振蕩器中振蕩10 min，用水定容至100 mL刻度，混勻，0.2 m微孔濾膜過濾，用于氨基柱測定。參考色譜條件鈣型陽離子交換柱參考色譜條件鈣型陽離子交換柱（6.5 mm300 mm， 5 m）；或具有同等性能的色譜柱。檢測器溫度：40。流動相流速：0.5 mL/min。柱溫：80。進樣量：20 L。流動相：高純水。氨基柱參考色譜條件氨基柱（250 mm4.6 mm，5 m）；或具有同等性能的色譜柱。流動相：乙腈：水70：30。流動相流速：1.0 mL/min。檢測器溫度：40。柱溫：35。進樣量：20 L。定性測定按照鈣型陽離子

7、交換柱參考色譜條件（A.2.1.4.2.1）穩(wěn)定好高效液相色譜，將半乳糖、葡萄糖、乳糖、低聚半乳糖三糖、低聚半乳糖四糖、低聚半乳糖五糖、低聚半乳糖六糖混合標準溶液（A.2.1.2.2），注入高效液相色譜儀中，記錄不同聚合度糖的保留時間，與待測樣品中組分的保留時間進行定性，面積歸一化法測定各組分相對百分含量，定性色譜圖參見附錄B。按照氨基柱參考色譜條件（A.2.1.4.2.2）穩(wěn)定好高效液相色譜，將半乳糖二糖、乳糖、異乳糖混合標準溶液（A.2.1.2.3）注入高效液相色譜儀中，面積歸一化法測定各組分相對百分含量，定性色譜圖參見附錄B。結(jié)果計算 鈣型陽離子交換柱，試樣中組分i占總糖的相對百分比含量

8、按照式（A.1）計算： （A.1）式中：DPi 試樣中組分i占總糖的百分含量，%；Ai 試樣中組分i的峰面積； Ai 試樣中所有各組分的峰面積的總和。氨基柱，試樣中乳糖在總二糖中的百分比含量按照公式（A.2）計算。 （A.2）式中：X乳 試樣中的乳糖在總二糖中的百分含量，%；A半 試樣中的半乳二糖的峰面積；A異 試樣中的異乳糖的峰面積；A乳 試樣中的乳糖的峰面積。試樣中低聚二糖（含二糖）以上組分占總糖中的百分比含量按照公式（A.3）計算。=100- - （A.3）式中：Gn 試樣中的低聚二糖（含二糖）以上組分占總糖中的百分含量（占干物質(zhì)），%；DP半 試樣中的半乳糖在總糖中的百分含量，%；DP

9、葡 試樣中的葡萄糖在總糖中的百分含量，%；DP2 總二糖（半乳糖二糖、乳糖、異乳糖）在總糖中的百分含量，%。精密度在重復性測定條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不超過其算術平均值的5%。高效離子交換色譜法（仲裁法）方法提要用磷酸鹽緩沖液提取試樣中游離的低聚半乳糖和乳糖，采用半乳糖苷酶將提取液中低聚半乳糖和乳糖酶解，將提取的初始溶液和酶處理過的溶液分別用高效離子色譜儀測定。第一步測定初始溶液中游離的半乳糖和乳糖，第二步測定從低聚半乳糖和乳糖中釋放出的半乳糖總量。利用乳糖和半乳糖的含量計算試樣中低聚半乳糖的含量。試劑和材料除另有說明外，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

10、磷酸二氫鉀。XX磷酸氫二鉀。濃鹽酸。氫氧化鈉。無水醋酸鈉。乙腈：色譜級。半乳糖苷酶：活性約50000 U/g，來源于米曲霉的。無水半乳糖：純度 99%。乳糖：純度 99%。 磷酸鹽緩沖液（0.2M，pH6.0）分別稱取22.0 g磷酸二氫鉀和6.0 gXX磷酸氫二鉀，于適量的水中溶解，用水稀釋至1 L，120高壓滅菌器中滅菌30 min，備用。鹽酸溶液（0.1mol/L） 吸取0.83 mL濃HCl加水稀釋至100 mL。氫氧化鈉溶液（50%，碳酸鈉雜質(zhì)含量小于1%） 稱取100 g氫氧化鈉，加100 mL水，攪拌至完全溶解，靜置至碳酸鈉沉淀，上層液體澄清（約需10天）。不用時密封。氫氧化鈉溶

11、液（0.1M）取5.4 mL氫氧化鈉溶液（A.2.2.2.12），加無二氧化碳的水定容至100 mL。-半乳糖苷酶溶液（2000 U/mL） 取適量半乳糖苷酶（A.2.2.2.7）混懸于磷酸鹽緩沖液中，制成最終活力單位為2000 U/mL的酶溶液，使用前充分振搖混懸液，酶混懸液制備后8 h內(nèi)使用。 乙腈溶液（20%，體積比）取200 mL乙腈（A.2.2.2.6）加水稀釋定容至1 L。氫氧化鈉溶液（250 mmol/L） 取13.9 mL氫氧化鈉溶液（A.2.2.2.12），轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，去離子水定容至刻度，使用前脫氣30 min。乙酸鈉溶液（1 mol/L） 稱取82.04 g無水乙

12、酸鈉，用適量的水溶解并轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，水定容至刻度，0.2 m濾膜過濾。使用前脫氣30 min。半乳糖標準儲備液（1000 mg/mL）取一定量半乳糖在105烘箱中干燥4 h，準確稱取100 mg干燥后的半乳糖，加水溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度。 乳糖標準儲備液（950mg/mL）取一定量乳糖在105烘箱中干燥4 h。準確稱取100 mg干燥后的乳糖，加水溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度。注：上述烘干后的乳糖乘以0.95即為無水乳糖重量。葡萄糖標準儲備液（1000 mg/L）稱取一定量葡萄糖在105烘箱中干燥4 h，準確稱取100 mg干燥后的葡萄糖，

13、加水溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度。半乳糖、乳糖、葡萄糖混合工作液（100 mg/L）分別移取半乳糖、乳糖、葡萄糖的標準儲備液（1000mg/L）各10.0 mL，于100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度。儀器和設備高效離子色譜儀：配備脈沖安培檢測器（PAD）。色譜柱：陰離子交換色譜柱（250 mm3 mm），保護柱（50 mm3 mm）。pH計。分析天平：精度0.1 mg。水浴鍋振蕩器。 移液器：100 L及1000 L離心機：在11000g操作。 離心管：2.0 mL。 超聲清洗機：帶有脫氣功能。渦旋混合器。色譜參考條件柱溫：30； 流動相：洗脫梯度見表A.1；表A.1梯度

14、洗脫程序表時間（min）A%氫氧化鈉溶液（250 mmol/L）B%醋酸鈉溶液（1 mol/L）C%水0.008.00.092.010.008.00.092.012.006.00.094.025.006.00.094.026.0050.050.00.036.0050.050.00.036.5050.00.050.042.0050.00.050.043.008.00.092.048.008.00.092.0流動相流速：0.4 mL/min；進樣量：20 L。分析步驟標準溶液的制備 分別量取半乳糖、乳糖和葡萄糖混合標準工作液（A.2.2.2.21）0.5 mL、1.0mL、2.0 mL、5.0mL

15、、10.0mL置于100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，制成系列混合標準工作溶液，見表A.2。按照色譜條件A.2.2.4進行測定，以各組分的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。表A.2 半乳糖、乳糖和葡萄糖標準溶液半乳糖（g/mL）乳糖（g/mL）葡萄糖（g/mL）0.500.4750.501.000.951.002.001.902.005.004.955.0010.009.5010.00試樣液的制備準確稱取取0.1 g試樣（精確至0.001 g），用適量的磷酸鹽緩沖溶液（A.2.2.2.10）溶解并轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，搖勻，鹽酸溶液（A.2.2.2.11）和用氫氧化鈉溶液

16、（A.2.2.2.13）調(diào)節(jié)pH至5.76.3之間，然后用磷酸鹽緩沖溶液（A.2.2.2.10）定容至刻度，混勻。試樣液的處理A.2.2.5.3.1 乳糖和總低聚半乳糖的酶解試樣的制備吸取制備的試樣液10 mL（A.2.2.5.2），移入100 mL容量瓶中，標記為A1，吸取1 mL半乳糖苷酶溶液（A.2.2.2.14），放入A1中，用鋁箔紙密閉，輕輕搖勻。A.2.2.5.3.2 乳糖和半乳糖的初始試樣溶液制備吸取1 mL半乳糖苷酶溶液（A.2.2.2.14），加入100 mL容量瓶中，標記為A0，在100水浴加熱10 min使酶失活，放至室溫，再吸取制備的試樣液10 mL（A.2.2.5.2

17、）放入A0中，用鋁箔紙密閉，輕輕搖勻。A.2.2.5.3.3 試樣酶解將含有活性酶A1和失活酶A0的2個100 mL容量瓶在（602）水浴中持續(xù)溫和振搖30 min（從混合物溫度達到60開始計算加熱時間，振搖過程中避免形成水沫或空氣泡沫），然后將A0、A1兩個處理溶液，用冰浴冷卻至室溫。A.2.2.5.3.4 向A0、A1兩個100 mL容量瓶中，各加入20%乙腈溶液（A.2.2.2.15）5 mL，用水定容，混勻。分別取適量上述處理后溶液至離心管中，10000g離心10 min，上層水相用0.2 m濾膜過濾。試樣測定分別吸取離心后的試樣溶液適當稀釋后，稀釋倍數(shù)為D，按照色譜條件（A.2.2.

18、4）進樣測定樣液中的半乳糖、乳糖含量，根據(jù)標準品的保留時間進行試樣中各糖組分的色譜峰的定性；根據(jù)標準工作曲線計算試樣中的半乳糖、乳糖含量，試樣及標準品的色譜圖見附錄C。結(jié)果計算根據(jù)色譜分析結(jié)果，按照下列公式計算初始試樣A0中游離的半乳糖、乳糖含量，酶解產(chǎn)物A1中總半乳糖含量，最終計算出低聚半乳糖的含量。樣液A0中游離半乳糖的計算試樣A0中游離半乳糖含量以半乳糖的質(zhì)量分數(shù)w1計（占干物質(zhì)），數(shù)值以%表示，按式（A.4）計算： （A.4） 式中：w1 試樣中游離半乳糖的含量，單位為（g/100g） A1 標準曲線上查得的半乳糖的含量，單位為微克每毫升（g/mL）； V1 試樣制備定容體積（mL）；

19、 V2 試樣酶解處理后定容體積（mL）； D 樣液A0的稀釋倍數(shù)； m 試樣質(zhì)量，單位為克（g）； V3 試樣酶解時取試樣制備的體積（mL）。樣液A0中游離乳糖的計算試樣A0中游離乳糖含量以乳糖的質(zhì)量分數(shù)w2計（占干物質(zhì)），數(shù)值以%表示，按式（A.5）計算： （A.5）式中： w2 試樣中游離乳糖的含量，單位為（g/100g）； A2 標準曲線上查得的乳糖的濃度，單位為微克每毫升（g/mL）； V1 試樣制備定容體積（mL）； V2 試樣酶解處理后定容體積（mL）； D 稀釋倍數(shù)； m 試樣質(zhì)量，單位為克（g）； V3 試樣酶解時取試樣制備的體積（mL）。計算游離的乳糖酶解釋放的半乳糖含量試樣

20、A0中游離的乳糖水解釋放的半乳糖以半乳糖的質(zhì)量分數(shù)w3計（占干物質(zhì)），數(shù)值以%表示，按式（A.6）計算： （A.6） 式中：w3 游離的乳糖水解釋放的半乳糖含量，單位為（g/100g）； 1.9 折算系數(shù)。樣液A1中總半乳糖的計算試樣A1中總半乳糖含量以半乳糖的質(zhì)量分數(shù)w4計（占干物質(zhì)），數(shù)值以%表示，按式（A.7）計算： （A.7）式中：w4 試樣中總半乳糖含量含量，單位為（g/100g）； A3 標準曲線上查得的A1液中半乳糖的濃度，單位為微克每毫升（g/mL）； V1 試樣制備定容體積（mL）； V2 試樣酶解處理后定容體積（mL）； D 稀釋倍數(shù)； m 試樣質(zhì)量，單位為克（g）； V3

21、 試樣酶解時取試樣制備的體積（mL）。樣液A1中低聚半乳糖水解釋放半乳糖的計算樣液A1中低聚半乳糖水解釋放半乳糖的含量以半乳糖的質(zhì)量分數(shù)w5計（占干物質(zhì)），數(shù)值以%表示，按式（A.8）計算： （A.8） 式中：w5 樣液A1中低聚半乳糖水解釋放半乳糖的含量（g/100g）。試樣中低聚半乳糖含量的計算 試樣中低聚半乳糖的質(zhì)量分數(shù)w6計（占干物質(zhì)），數(shù)值以%表示，按式（A.9）計算： （A.9）式中：w6 試樣中低聚半乳糖的含量，單位為（g/100g）；k 低聚半乳糖與酶解釋放的半乳糖換算系數(shù)，的推薦值為1.3559，也可按照附錄D進行測定。精密度 在重復性測定條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差

22、值不超過其算術平均值的5%。乳糖含量的測定 高效液相色譜雙柱法分析步驟 同A.2.1.4，結(jié)果計算 試樣中乳糖的質(zhì)量分數(shù)W乳計（占干物質(zhì)），數(shù)值以%表示，按式（A.10）計算： W乳= （A.10）W乳 試樣中的乳糖的含量，%；X乳 試樣中的乳糖在總二糖中的百分含量，%；DP2 總二糖（半乳糖二糖、乳糖、異乳糖）在總糖中的百分含量，%。精密度 在重復性測定條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不超過其算術平均值的5%。高效離子交換色譜法分析步驟 吸取制備的試樣液10mL（A.2.2.5.2），移入100mL容量瓶中，加水定容至100mL混勻，溶液過0.22m 濾膜過濾，適當稀釋后進離子色譜儀測

23、定，稀釋倍數(shù)為D4。結(jié)果計算 乳糖含量以乳糖的質(zhì)量分數(shù)w乳計（占干物質(zhì)），數(shù)值以%表示，按式（A.11）計算： （A.11）式中： W乳 試樣中乳糖的含量，單位為（g/100g）； A2 標準曲線上查得的乳糖的濃度，單位為微克每毫升（g/mL）； V1 試樣制備定容體積（mL）； D 稀釋倍數(shù)； m 試樣質(zhì)量，單位為克（g）；精密度 在重復性測定條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不超過其算術平均值的5%。葡萄糖含量的測定高效液相色譜雙柱法分析步驟 同A.2.1.4。結(jié)果計算 同A.2.1.6.1。高效離子交換色譜法分析步驟 吸取制備的試樣液10 mL（A.2.2.5.2），移入100 mL

24、容量瓶中，加水定容至 100mL 混勻，溶液過 0.22 um 濾膜過濾，適當稀釋后進離子色譜儀測定。結(jié)果計算 葡萄糖含量以葡萄糖的質(zhì)量分數(shù)w葡計（占干物質(zhì)），數(shù)值以%表示，按式（A.12）計算： （A.12）式中： w葡 試樣中葡萄糖的含量，單位為（g/100g）； A2 標準曲線上查得的葡萄糖的濃度，單位為微克每毫升（g/mL）； V1 試樣制備定容體積（mL）； D 稀釋倍數(shù)； m 試樣質(zhì)量，單位為克（g）；精密度 在重復性測定條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不超過其算術平均值的5%?？扇苄怨绦挝锖康臏y定儀器和設備手持糖量計分析步驟儀器校正分開兩面棱鏡，用潔凈玻璃棒取2滴重蒸蒸餾

25、水于固定的棱鏡面上，立即閉合棱鏡，停留幾秒鐘，使試樣達到棱鏡溫度，以重蒸蒸餾水在20，相當于固形物含量為零，對準光源，觀察明暗分界線。若明暗分界線不在零點，調(diào)節(jié)糖量計的調(diào)節(jié)螺母，直至明暗分界線與零點重合。測定清潔棱鏡面并保持干燥，用玻璃棒取少量試樣于固定的棱鏡面上，立即閉合棱鏡，停留幾秒鐘，使試樣達到棱鏡溫度。從標尺上讀取固形物質(zhì)量分數(shù)，再重復檢測一次，每個試樣至少測定二次，取算術平均值報告其結(jié)果。硫酸灰分的測定儀器和設備高溫爐。試劑和材料硫酸。分析步驟稱取試樣1 g（精確至0.0001 g），放入已灼燒至恒重的瓷坩堝中，在電爐上緩緩灼燒至完全炭化，冷卻至室溫。加入0.5 mL硫酸使?jié)駶櫍蜏?/p>

26、加熱至硫酸蒸汽出盡。然后移入高溫爐中800 25 灼燒至恒重。結(jié)果計算 灼燒殘渣以質(zhì)量分數(shù)w8計，數(shù)值以%表示，按公式（A.13）計算： （A.13）式中： w8 試樣中的硫酸灰分的質(zhì)量分數(shù)，數(shù)值以%表示； m5 灼燒后瓷坩堝與殘渣質(zhì)量，單位為克（g）； m6 空坩堝質(zhì)量，單位為克（g）； m4 試樣與空坩堝質(zhì)量，單位為克（g）。實驗結(jié)果以平行測XX果的算術平均值為準。在重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值與算術平均值的比值不大于1%。pH的測定儀器酸度計：精度0.01pH，備有玻璃電極和甘汞電極（或復合電極）。分析步驟按儀器使用說明書調(diào)試和校正酸度計。用新煮沸冷卻的中性蒸餾水配制30%的低聚半乳糖液待測液。然后，用水沖洗電極探頭，用濾紙輕輕吸干，將電極插入待測樣液中，調(diào)節(jié)溫度調(diào)節(jié)器，使儀器指示溫度與溶液溫度相同，穩(wěn)定后讀數(shù)。所得結(jié)果表示至一位小數(shù)。（資料性附錄）雙柱法測定低聚半乳糖的譜圖 圖 B.1鈣型陽離子交換柱測定低聚半乳糖的色譜圖 圖 B.